影响胶体金快速定量法检测玉米呕吐毒素的因素*

时间:2023-09-28 15:05:01 来源:网友投稿

周连妹 李智深 黄敏如

(广东省储备粮管理集团有限公司韶关直属库 512000)

目前,呕吐毒素检测方法主要有高效液相色谱法、薄层色谱法、酶联免疫法等[10],其中高效液相色谱法虽可精确定量,但样品前处理较繁琐,对操作人员的素质要求较高,且仪器昂贵,检测成本较高,适合大型企业、科研院校、检测机构或对检测灵敏度要求较高的单位零散使用,不适合基层粮库应用于大批量收粮现场。相比之下,便捷、灵敏、低成本及适合大批量样品筛选的酶联免疫检测方法(ElISA)越来越受到关注[11-12]。本文以胶体金快速定量法检测玉米呕吐毒素为例,通过实验分析总结了影响检测结果的因素,以期为提高检测结果的准确性提供参考。

1.1 实验材料

2021年产自吉林和黑龙江的普通黄玉米。

1.2 主要设备和试剂

主要设备及试剂如表1。

表1 主要设备及试剂

1.3 实验方法

1.3.1 样品前处理 样品按以下5种前处理方式分别进行制备。

(1)将2 kg玉米充分混匀后用四分法分出4份,每份约500 g,分别去除杂质后粉碎至全部通过0.9 mm孔径的筛子,混匀备用。

(2)将2 kg玉米充分混匀后用四分法分出4份,每份约100 g,分别去除杂质后粉碎至全部通过0.9 mm孔径的筛子,混匀备用。

(3)将2 kg玉米去除杂质后粉碎至全部通过0.9 mm孔径的筛子,充分混匀后用四分法分出4份,每份约500 g,混匀备用。

(4)将2 kg玉米去除杂质后粉碎至全部通过0.9 mm孔径的筛子,充分混匀后用四分法分出4份,每份约100 g,混匀备用。

(5)将2 kg玉米充分混匀后用四分法分出2份,每份约500 g,分别去除杂质后粉碎至全部通过0.9 mm和2.0 mm孔径的筛子,混匀备用。

1.3.2 测定步骤

(1)准确称量5.0 g粉碎样品于50 mL离心管,加入25 mL去离子水,涡旋振荡1 min,静置1 min。

(2)取1000 μL上清液于1号离心管中,放入离心机5000 r/min,离心1 min。

(3)从1号离心管中取100 μL样品提取液放入2号离心管,加入1000 μL稀释缓冲液(DONQ),涡旋振荡10 s。

(4)将呕吐毒素快检试剂条放入孵育器中,胶纸撕开至黑线处,取300 μL待测稀释液,缓慢加入试剂条凹槽中后盖上胶纸,45℃孵育5 min。

(5)读数仪调至DON-00档,读数。

(6)当数值显示1501+时,需二次稀释:从2号离心管取300 μL溶液放入3号离心管,加入1000 μL稀释缓冲液(DONQ),涡旋振荡10 s。再重复上述步骤(4)。

(7)读数仪调至DON-01档,读数。

2.1 质控样品检测

按照产品说明要求,分别检测检测条自带的阴性质控和阳性质控样品,结果如表2。

表2 质控样品检测情况表

由表2可知,阳性质控检测结果均在500 μg/kg~1500 μg/kg范围内,阴性质控检测结果均小于100 μg/kg,说明本检测试条质量合格。

2.2 重复性试验

根据设备操作步骤说明,将一个1040 μg/kg实物标准样品重复检测6次,结果如表3。

表3 重复性试验情况表

由表3可知,实物标准样品呕吐毒素检测值的相对标准偏差未超出10%,说明该方法重复性较好。

2.3 粉碎样品量和样品缩分方式

取DON未超标的玉米(样品1-1和样品1-2)和超标的玉米(样品2-1和样品2-2)各一份,分别按样品前处理(1)和(2)方式制得待测样品,检测结果见表4-1。

表4-1 先缩分后粉碎检测结果对比表

分别取DON未超标的玉米(样品1-3和样品1-4)和超标的玉米(样品2-3和样品2-4)各一份,分别按样品前处理(3)和(4)方式制得待测样品,检测结果见表4-2。

表4-2 先粉碎后缩分检测结果对比表

从表4-1和表4-2可知:粉碎样品量和样品缩分方式均对样品DON检测数值的离散度有影响,且毒素超标样品的检测值离散度变化更为显著。同一DON含量水平的玉米样品,其检测值的变异系数随粉碎样品量减少而增大。从表4-1来看,粉碎样品量从500 g降到100 g时,DON含量未超标样品的检测值,变异系数增加了6.2个百分点;
DON含量超标样品的检测值,变异系数增加了16.1个百分点。且粉碎样品量为100 g时,同一份原始样品分出的四份次级样品的检测值已超出该方法的重复性要求[13]。从表4-2来看,同一粉末状样品,即先粉碎混匀后缩分,检测值离散程度最小,但较高含量样品的变异系数仍比低含量样品的大。

分析可能有以下原因:一是读数仪本身在不同数值范围的精密度不同导致。读数仪在数值未超过1000 μg/kg时,采用50进制,数值超过1000 μg/kg时,采用100进制。二是样品本身毒素含量分布不均匀导致。先粉碎后缩分一方面是样品粉碎量增加了,另一方面经研磨粉碎后样品粒径大大降低,在此基础上充分混匀有助于被测组分的均匀分布。玉米籽粒中水分等营养成分较高,在生长、运输、存储等环节易受真菌感染,在光照、温度、水分活度等环境条件适宜时,产毒霉菌会生长代谢出真菌毒素,产生的真菌毒素在玉米籽粒间的分布具有随机性、不均匀的特点[14]。有些粮堆中受产毒霉菌污染的粮食颗粒很少,而被污染的籽粒中毒素含量极高[15],在样品量较少时,玉米颗粒较大的特点使样品不均匀性进一步凸显。三是试样量较少(5.0 g)对检测结果产生一定程度的影响。试样量越少检测结果误差越大,研究证明适当增加试样量可缩小双试验误差[16]。

综上所述,检测玉米呕吐毒素时,制样环节非常关键。特别是处理毒素含量较高的样品时,简单地缩分出少量样品进行粉碎,极有可能出现同一样品检测值超出允许偏差范围的情况。因此,需特别注意制备样品的均匀性和代表性,适当增加粉碎样品量和试样量。在确保准确的同时兼顾考虑经济和效率,应在充分混匀的原始样品中缩分出不少于500 g进行粉碎,且粉碎后的待测样品要充分混匀再称取足量试样检测。处理临界值样品时,在充分混匀原始样品基础上,适当增加粉碎样品量,并结合多次独立检测取平均值的方式确定。

2.4 样品细度影响分析

取9个玉米样品,按样品前处理(5)方式制得待测样品,检测结果见表5。

表5 样品细度检验结果对比表

由表5可知:经配对T检验方差分析,T=2.395>T0.05,8=2.31,表明两种样品细度的检测值之间存在显著性差异,说明样品粗细对DON检测值有显著影响。无论样品DON含量高低,样品粉碎颗粒大的检测值均比粉碎颗粒小的低。且样品DON含量越高,相差值越大。原因可能是样品粒径大的样品表面积小,同等提取条件下大样样品中的DON提取不充分,导致检测结果偏低。

2.5 与高效液相色谱法一致性

取6个样品,分别充分混匀后用四分法各分成两份,其中一份委托广东省质量监督粮油检验站用免疫亲和层析净化高效液相色谱法检测,另一份用胶体金快速定量法检测。样品充分混匀后分出500 g,去除杂质后粉碎至完全通过0.9 mm孔径的筛子,混匀备用,检测时室温控制在20℃~25℃。检测结果见表6。

表6 快速法与高效液相色谱法检测玉米样品结果对比

从表6可知:通过配对T检验方差分析,Tmax=2.086

2.6 与高效液相色谱法相关性

以HPLC检测值为横坐标,快速法检测值为纵坐标,通过一般线性模型拟合,发现两种方法的检测值具有一定相关性,如图1所示。当样品DON含量(<1500 μg/kg)较低时,两种方法检测值具有良好的线性关系。如图2所示,从线性回归方程:Y=0.9058X+5.3762可知,胶体金快速定量法测得值普遍比HPLC测得值高,且含量越高,相差越大。这与朱云等[17]的研究结论一致。

图1 两种方法检测值的线性拟合

图2 低浓度呕吐毒素两个方法检测值的线性拟合

3.1 胶体金快速定量法检测玉米呕吐毒素样品前处理简单,操作简便,检测速度快,重复性较好。在检测DON含量小于1500 μg/kg时,与高效液相色谱法具有良好的线性相关性,适合基层粮库应用于大批量样品的筛查;
在检测高浓度样品时,准确度与高效液相色谱法相比还存在一定差距。

3.2 制样环节对DON含量的准确分析尤为关键,应特别注意样品代表性和均匀性,粉碎样品量应不少于500 g;
处理临界值样品时,在充分混匀原始样品基础上,适当增加粉碎样品量,并结合多次独立检测取平均值的方式确定。

3.3 样品粉碎颗粒细度对检测值影响显著,粉碎粒径应能全部通过0.9 mm孔径的筛子。而在原有提取条件下增大粒径可能会使样品中DON提取不充分,导致结果偏低。

由于玉米DON含量高低取决于是否感染相应的产毒霉菌,而通过外观观察生霉粒和霉变粒多少无法准确判断DON含量,只能通过专业设备的检测得知[18-19],而检测分析的每一个环节都有可能影响检测结果。经总结实验室制样环节对检测结果的影响,同一份原始样品充分混匀后缩分得出多份小样粉碎,检测值的变异系数仍有不同的差异。进一步思考,DON在玉米等粮食中分布不均匀的特点在扦样环节同样需要特别注意。扦样是检测分析的第一步,样品扦样是真菌毒素检测分析过程中最主要的变异或误差来源,是准确分析的决定因素[20]。扦样点、扦样量对真菌毒素检测结果影响较大[21]。如果扦样操作不规范或比较随意,导致样品代表性失真,再准确的检测结果对于被扦样品来说也将毫无意义。随着检测分析中新技术和新方法的应用,检测准确度和精密度不断提高,而扦样环节却没有引起足够重视。因此,为更好保证检测结果的准确性,保障粮食安全,笔者认为需进一步针对DON等真菌毒素分析检测制定相应的标准,细化扦样操作规范,并加强相关人员技能培训,确保扦样代表性。

由于检测过程涉及的提取液体积较小,在规范操作移液枪的前提下,应考虑检验室环境温度变化对溶液体积的影响,而相关标准仅要求稀释缓冲液从冷藏取出放置室温后再使用[13]。根据工作经验,不同室温对检测结果有不同程度的影响,因此建议进一步研究讨论明确室温严格控制在20℃~25℃,有助于保障检测准确性。

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