吴樟桦， 胡莉， 李锦妍， 张林， 黄月纯，3， 李运容， 魏刚
（1.广州中医药大学中药学院，广东广州 510006；
2.广州中医药大学第一临床医学院，广东广州 510006；
3.广州中医药大学第一附属医院，广东广州 510405；
4.广西中医药大学附属国际壮医医院，广西南宁 530201）
铁皮石斛为兰科植物铁皮石斛Dendrobium officinaleKimuraetMigo 的干燥茎，具有益胃生津、滋阴清热的功效，为传统名贵珍稀中药材[1]。北宋苏颂编撰具官修性质的《本草图经》记载：“石斛，生六安山谷水傍石上，今荆湖、川、广州郡及温、台州亦有之，以广南者为佳。”此后，明清的主要本草基本沿用了石斛“以广南者为佳”的记载，此处的“广南”意为宋朝时期的“广南路”，意指今天的广东、广西两省[2]。本课题组前期进行了大量的本草考证和实地考察，本草记载应用最广、最久的药用石斛应为铁皮石斛，且广西、广东为铁皮石斛的主要道地产区之一，已有1 000年以上的应用历史[3]。
核苷类物质是生命活动过程中的重要代谢产物，在抗肿瘤、保护心肌损伤、抗病毒、免疫调节、抗菌抗炎等生命调节过程中起着重要的作用[4-6]。一直以来，人们利用核苷类物质特性，研发了多种核苷类药物用于人类疾病等领域中。与此同时，天然核苷类物质在医药领域也持续受到科学关注。近年来，它不仅被作为人类疾病诊断的生物标志物，在中药材品质评价及质量研究中也是重要的生物活性成分检测指标，甚至作为质量标记用于名贵药材品质评价。如2020 年版《中国药典》中规定，冬虫夏草腺苷的含量不得少于0.01%[7]。因此，分析广西铁皮石斛核苷类成分具有重要的研究意义。
中药多糖具有免疫调节、抗肿瘤、降血脂、抗辐射、抗虫害等作用[8]。多糖是铁皮石斛的重要成分，铁皮石斛因含有较高的多糖含量而区别于其他品种的石斛，《中国药典》对铁皮石斛中D-甘露糖、D-葡萄糖的含量和比值作了明确规定[7]。已有研究表明，铁皮石斛中D-甘露糖与D-葡萄糖高效液相色谱（HPLC）含量测定方法重复性较好，用两者含量之和替代具有较大误差的总多糖含量作为测定指标具有可行性[9]。但针对广西产区的铁皮石斛以及生长年限、种植模式对多糖含量影响尚不清楚。
本研究建立了鸟苷、尿苷、腺苷以及多糖类成分（D-甘露糖和D-葡萄糖）HPLC 含量测定方法，并选取24 批不同生长年限和种植模式的广西铁皮石斛进行含量测定，分析广西铁皮石斛核苷类及多糖类成分的范围，并探讨生长年限与种植模式对这些成分含量的影响，为广西铁皮石斛的质量控制提供参考依据。现将研究结果报道如下。
1.1 仪器与试剂MS-204S（d=0.1 mg）电子天平（瑞士Mettler Teledo公司）；
MS-105 Du（d=0.01 mg）电子天平（瑞士Mettle Toledo 公司）；
KQ-400KDE超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；
金刚手提式多功能粉碎机（上海市广沙工贸有限公司）；
真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；
DHG-9245A型电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；
予华SHZ-D（III）循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限公司）；
高效液相色谱仪（美国Agilent 公司，HP1260）；
TDZ4-WS 型离心机（长沙湘智离心机仪器有限公司）；
卤素水分测定仪（HB43-S）。乙睛（色谱纯），甲醇（色谱纯）均购自德国Merck 公司；
水为屈臣氏蒸馏水，三氯甲烷、盐酸等其他试剂均为分析纯。
2.1 核苷类成分（尿苷、鸟苷、腺苷）含量测定研究
2.1.1 对照品溶液的制备 分别取尿苷对照品2.1 mg、鸟苷对照品2.4 mg、腺苷对照品2.3 mg，精密称定，置于25 mL容量瓶中，加60%甲醇稀释至刻度，分别制成尿苷对照品溶液（0.084 mg/mL）、鸟苷对照品溶液（0.096 mg/mL）、腺苷对照品溶液（0.092 mg/mL）。
2.1.2 供试品溶液制备 石斛鲜品洗净，去除其根、叶，取其茎，切碎后冷冻干燥或采用60 ℃低温热风干燥，干品粉碎，过65 目筛（四号筛），所有样品低温干燥保存。精密称取样品粉末（过四号筛）各1 g，精密称定，加入50 mL 80%甲醇，超声处理1 h，取出，放冷至室温，滤过，用甲醇适量洗涤滤渣，合并滤液，挥干溶剂，残渣加60%甲醇使其溶解，置于10 mL容量瓶中，加60%甲醇至刻度，摇匀，即得供试品溶液，用于含量测定。
2.1.3 色谱条件 Zorbax SB Aq柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；
流动相为水（A）-甲醇（B），梯度洗脱（0～10 min，99%～95%B；
10～15 min，95%～85%B；
15 ～20 min，85%～80%B；
20 ～30 min，80%～80%B；
30 ～35 min，80%～99%B）；
流速1.2 mL/min；
柱温20 ℃；
检测波长260 nm；
进样量4 μL。分离度良好，如图1所示。
图1 核苷类成分对照品及广西铁皮石斛样品（S13）高效液相色谱（HPLC）图谱Figure 1 High performance liquid chromatography（HPLC）chromatogram of Dendrobium nucleoside components control and the sample of Dendrobium officinale from Guangxi（S13）
2.1.4 方法学考察
2.1.4.1 精密度考察 精密吸取同一供试品溶液（S13）4 μL，连续进样6 次，记录峰面积。结果显示：尿苷平均峰面积为99.093，相对标准偏差（RSD）为0.98%；
鸟苷平均峰面积为87.700，RSD为0.62%；
腺苷平均峰面积为187.279，RSD 为1.66%。结果表明仪器精密度良好。
2.1.4.2 稳定性考察 精密吸取同一供试品溶液（S13）4 μL，分别在0、4、8、12、18、24 h 进样，记录峰面积。结果显示：尿苷平均峰面积为100.850，RSD为0.74%；
鸟苷平均峰面积为88.184，RSD 为0.73%；
腺苷平均峰面积为186.824，RSD为1.15%。结果表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。
3．3 本研究的临床意义 心理理论是儿童重要的社会技能之一，而愿望和信念理解又是儿童心理理论发展中的两项重要能力。孤独症儿童的社会交往障碍与其心理理论缺失有很大关系。本研究显示智龄在3～5岁的孤独症儿童能理解愿望，却在信念推理与错误信念理解方面存在困难。这说明对智龄较小的孤独症来说愿望理解更容易。因此，在临床康复训练时，应该针对孤独症儿童心理理论自身发展的特点，从愿望理解方面着手，训练儿童区分自己和他人的愿望，了解愿望－情绪－行为之间的关系，并以此为基础训练儿童对信念的理解。
2.1.4.3 重复性考察 取同一样品（S13）6 份，依法制备，进样测定，记录峰面积。结果显示：尿苷平均含量为0.727 1 mg/g，RSD 为0.88%；
鸟苷平均含量为0.122 2 mg/g，RSD 为0.79%；
腺苷平均含量为0.257 9 mg/g，RSD 为0.33%。结果表明该方法重复性良好。
2.1.4.4 线性范围考察 分别从“2.1.1”项下各对照品溶液中取出1 mL 置于5 mL 容量瓶，加60%甲醇定容至刻度，制成尿苷（0.016 73 mg/mL）、鸟苷（0.019 20 mg/mL）、腺苷（0.018 40 mg/mL）混合对照溶液。依照“2.1.3”项下色谱条件入液相色谱仪，进样体积依次为0.5、1、2、5、7.5、10、12.5、15 μL，记录峰面积。以对照品进样量（X）为横坐标，对照品峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，计算各对照品的回归方程。各对照品的回归方程如表1所示。
表1 尿苷、鸟苷、腺苷线性关系Table 1 Linear relation test results of uridine，guanosine，adenosine
2.1.4.5 加样回收率考察 称取已知含量的广西铁皮石斛样品（S13）各6 份，每份约0.5 g，精密称定，按“2.1.2 ”项下方法提取，进行测定，记录峰面积，并计算回收率和RSD。结果显示：尿苷平均回收率102.08%，RSD 为1.92%；
鸟苷的平均回收率99.79%，RSD 为2.00%；
腺苷的平均回收率100.39%，RSD 为2.28%。结果如表2所示。
表2 尿苷、鸟苷、腺苷平均加样回收率结果Table 2 Average recovery results of uridine，guanosine，adenosine
2.1.5 样品的测定 取不同批次的广西铁皮石斛样品粉末，按“2.1.2”项下供试品溶液的制备方法制备样品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件测定，记录尿苷、鸟苷、腺苷的峰面积，计算含量及三者含量之和。所有样品的含量测定结果如表3所示。
表3 24批广西铁皮石斛核苷类成分含量测定结果Table 3 Determination results of the contents of nucleosides in 24 batches of Dendrobium officinale from Guangxi
2.2D-甘露糖、D-葡萄糖HPLC柱前衍生含量测定
2.2.1 对照品与供试品溶液的制备 同文献研究[10]的制备方法。
2.2.2 色谱条件 同文献研究[10]的色谱条件。结果分离度良好，如图2所示。
图2 混合单糖对照品与广西铁皮石斛样品（S14）高效液相色谱（HPLC）图谱Figure 2 HPLC chromatogram of mixed monosaccharide reference substance control and the sample of Dendrobium officinale from Guangxi（S14）
2.2.3 相对校正因子的计算 同文献研究[10]的校正因子计算。
2.2.4 方法学考察
2.2.4.1 精密度考察 精密吸取同一供试品溶液（S14）10 μL，连续进样6 次，记录峰面积。结果显示：D-甘露糖平均峰面积为2 897.85，RSD 为0.93%；
D-葡萄糖平均峰面积为408.74，RSD 为2.33%。结果表明仪器精密度良好。
2.2.4.2 稳定性考察 精密吸取同一供试品溶液（S14）10 μL，分别在0、2、4、6、8、16、24 h 进样，记录峰面积。结果显示：D-甘露糖平均峰面积为2 875.46，RSD 为1.35%；
D-葡萄糖平均峰面积为408.41，RSD 为1.01%。结果表明，供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.2.4.3 重复性考察 取同一样品（S14）6 份，依法制备，进样测定，记录峰面积。结果显示：D-甘露糖平均含量为31.61%，RSD 为1.43%；
D-葡萄糖平均含量为4.76%，RSD 为1.32%。结果表明该方法重复性良好。
2.2.4.4 线性范围考察 同文献研究[10]的线性考察结果。
2.2.4.5 加样回收率考察 称取已知含量的广西石斛样品（S14）各6 份，每份约0.06 g，精密称定，按“2.2.1”项下方法提取。挥干后的滤纸筒拆开剪碎连同滤渣置于烧杯中，加水100 mL，并加入相当于样品D-甘露糖、D-葡萄糖含量的对照品。再精密加入内标溶液2 mL（12.016 mg/mL），按“2.2.1”项下方法制备，进行测定，记录峰面积，并计算回收率和RSD。结果显示：D-甘露糖平均回收率99.74%，RSD 为2.08%；
D-葡萄糖的平均回收率100.79%，RSD为2.37%。
2.2.5 含量测定 取不同批次的广西石斛样品粉末，按“2.2.1”项下供试品溶液的制备方法制备样品溶液，按“2.2.2”项下色谱条件测定，记录D-甘露糖、D-葡萄糖和内标物的峰面积。以内标法计算各样品中D-甘露糖含量、D-葡萄糖含量，并计算两者含量之和。结果见表4。
表4 广西铁皮石斛D-甘露糖、D-葡萄糖的含量及两者含量之和Table 4 Contents and the sum of D-mannose and D-glucose in Dendrobium officinale from Guangxi
3.1 广西铁皮石槲核苷类成分含量测定分析比较供试品不同溶媒（70%甲醇，80%甲醇，90%甲醇，甲醇）、不同提取时间（50、60、70 min）、料液比（1∶50、1∶75、1∶100）的提取效果，分析表明，因为核苷类成分的亲水性，采用含醇量较高的溶媒会降低提取效率，但采用70%甲醇溶液作为溶媒时会提取出更多水溶性物质，造成供试品杂质过多，极易堵塞仪器与色谱柱，故最后采用80%甲醇作为提取溶媒。对于不同的提取时间和料液比，都能达到较好的分离度，实验结果显示，以60 min、料液比1∶50 条件下，提取效率更高。
本研究测得的广西仿野生铁皮石斛的尿苷、鸟苷、腺苷平均含量以及这3种核苷成分总平均含量分别为0.075 6 ～0.160 0 mg/g（均值为0.109 1 mg/g）、0.070 4 ～0.195 4 mg/g（均值为0.124 1 mg/g）、0.096 4 ～0.217 3 mg/g（均值为0.147 3 mg/g）和0.242 4 ～0.564 6 mg/g（均值为0.380 4 mg/g）；
广西大棚种植铁皮石斛的尿苷、鸟苷、腺苷平均含量以及这3 种核苷成分总平均含量分别为0.040 6 ～0.147 2 mg/g（均值为0.086 4 mg/g）、0.039 5 ～0.153 9 mg/g（均值为0.085 6 mg/g）、0.079 8 ～0.197 9 mg/g（均值为0.118 1 mg/g）和0.159 9 ～0.490 7 mg/g（均值为0.290 1 mg/g）。结果表明，广西铁皮石斛核苷类成分含量相对较高，仿野生铁皮石斛3种核苷成分的平均含量比大棚种植的高，由此可见，核苷类成分在仿野生种植样品更有优势。
在仿野生种植样品中，根据生长年限一共分为1 ～2 年生和2 年及以上两组。1 ～2 年生样品的尿苷、鸟苷、腺苷平均含量以及这3 种核苷类成分总平均含量分别为0.110 1 ～0.160 0 mg/g（均值为0.136 8 mg/g）、0.135 3 ～0.195 4 mg/g（均值为0.166 3 mg/g）、0.129 5 ～0.217 3 mg/g（均值为0.184 9 mg/g）和0.386 4 ～0.564 6 mg/g（均值为0.488 1 mg/g）；
2 年及以上生样品的尿苷、鸟苷、腺苷平均含量以及这3种核苷类成分总平均含量分别为0.075 6 ～0.093 4 mg/g（均值为0.081 3 mg/g）、0.070 4 ～0.094 4 mg/g（均值为0.081 9 mg/g）、0.096 4 ～0.125 4 mg/g（均值为0.109 6 mg/g）和0.242 4 ～0.311 2 mg/g（均值为0.272 7 mg/g）。结果表明，随着生长年限的增加，广西仿野生铁皮石斛核苷类成分含量有降低趋势。
3.2 多糖（D-甘露糖、D-葡萄糖）含量的测定本研究参考课题组前期霍山石斛含量的测定方法，采用HPLC 柱前衍生的方法并进行了方法学的验证，结果表明此方法稳定可靠，可以用于广西铁皮石斛多糖含量的测定。
所有的广西铁皮石斛样品D-甘露糖含量范围17.71%～35.04%（均值为24.08%）、D-葡萄糖含量范围2.63%～14.02%（均值为5.84%）、D-甘露糖与D-葡萄糖含量之和范围20.34% ～44.35%（均值为29.92%）均符合药典相关含量限度要求。其中：仿野生广西铁皮石斛的D-甘露糖的平均含量为17.71%～35.04%（均值为23.72%），D-葡萄糖的平均含量为2.63%～5.73%（均值为4.18%），D-甘露糖与D-葡萄糖含量之和为20.34%～40.29%（均值为27.91%）；
大棚栽培广西铁皮石斛的D-甘露糖的平均含量为18.51% ～32.54%（均值为24.81%），D-葡萄糖的平均含量为5.87% ～14.02%（均值为9.14%），D-甘露糖与D-葡萄糖平均含量之和为25.32% ～44.35%（均值为33.95%）。从整体趋势来看，大棚种植广西铁皮石斛的多糖含量比仿野生样品高，这可能是因为在野外环境下，植物需要消耗更多的糖分等供能物质来维持自身代谢以及抵御恶劣环境的胁迫。
仿野生广西铁皮石斛1～2 年生样品的D-甘露糖的平均含量为20.36%～35.04%（均值为27.29%），D-葡萄糖的平均含量为3.93～5.73%（均值为4.75%），D-甘露糖与D-葡萄糖含量之和为24.43%～40.29%（均值为32.05%）；
2 年及以上样品的D-甘露糖的平均含量为17.71%～24.44%（均值为20.15%），D-葡萄糖的平均含量为2.63%～5.06%（均值为3.61%），D-甘露糖与D-葡萄糖平均含量之和为20.34%～27.97%（均值为23.76%）。在不同生长年份的仿野生铁皮石斛中，呈现出1～2 年生样品的多糖含量高于2～3 年生样品。
综上所述，广西铁皮石斛具有一定含量的核苷类成分和多糖成分，有一定的优越性，其核苷类和多糖成分的含量与种植模式和生长年限相关，可以为广西铁皮石斛的质量评价提供一定的依据。
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