张 薇, 秦冬梅, 冀祖恩, 孙琰琴, 罗恒磊, 于水莲, 彭一峰
(1新疆甘草及制品研究重点实验室; 2新疆全安药业股份有限公司, 新疆 库尔勒 841011; 3石河子大学药学院, 新疆 石河子 832002)
慢性非萎缩性胃炎是临床常见的消化系统疾病,以胃小凹之间的固有膜内有炎性细胞浸润为特征,发病率高,发病机制尚不明确,临床表现缺乏特异性,主要表现为非特异性消化不良,如上腹部不适、饱胀、疼痛、食欲不振、嗳气、泛酸等[1]。西医主要采用内镜与病理检查进行诊断,以质子泵抑制剂和胃黏膜保护剂对症治疗为主,多存在不良反应、易反复、患者依从性差等问题[2]。中医药治疗多采用中药多组分、多靶点协同作用,在慢性非萎缩性胃炎治疗中具有独特优势,且安全性高,疗效确切[3]。安胃疡胶囊由新疆全安药业股份有限公司生产,主要成分为总黄酮,具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗病毒、抗溃疡等作用,临床上主要用于胃及十二指肠球部溃疡的治疗[4]。本研究采用胃动力不足小鼠模型和慢性非萎缩性胃炎动物模型,探究安胃疡胶囊促胃动力作用及治疗慢性非萎缩性胃炎的作用机制,现报道如下。
1.1 动物SPF级SD大鼠,雌雄对半,体重180～220 g,由重庆市中药研究院实验动物研究所提供,动物生产许可证号:SCXK(渝)2012-0006,合格证号:0004652。SPF级昆明(KM)小鼠,雌雄对半,体重18～22 g,中国人民解放军第三军医大学实验动物中心提供,动物生产许可证号:SCXK(军)2012-0011,合格证号:0008104。实验动物饲养环境:室温20℃～25℃,相对湿度40%～70%, 12 h/12 h昼夜明暗交替,所有动物均自由进食饮水。
1.2 试药安胃疡胶囊(新疆全安药业股份有限公司,20180704),胃乃安胶囊(广州白云山中一药业有限公司,W00074),甲氧氯普胺片(山西云鹏制药有限公司,G180621),脱氧胆酸钠(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司,40N10202),硫酸阿托品注射液(天津金耀药业股份有限公司,1803061),胃蛋白酶(PP)试剂盒(南京建成生物工程研究所,20180922),胃泌素(GAS)试剂盒(E20180901A)、胃动素(MTL)试剂盒(E20181107A)、白介素1β(IL-1β)试剂盒(E20180622A)、白介素8(IL-8)试剂盒(E20181113A)、前列腺素E2(PGE2)试剂盒(E20180524A)均购自上海继锦化学科技有限公司;氨水(20180413)、乙醇(20181107)购自重庆川东化工集团有限公司化学试剂厂。
1.3 仪器Multifuge-X型3R低温高速离心机(美国Thermo Fisher公司),ST-360型酶标仪(科华试验系统有限公司),BX51型生物显微镜(日本奥林巴斯株式会社),DW-86L386型超低温保存箱(Haier集团有限公司),CLW-1020J-RO型纯水仪(乾崃仪器有限公司)。
1.4 方法
1.4.1 大鼠胃运动实验 取60只SD大鼠,随机分为空白对照组(纯化水),安胃疡低、中、高剂量组(安胃疡胶囊 82、164、328 mg/kg体重),胃乃安组(胃乃安370 mg/kg体重),甲氧氯普胺组(甲氧氯普胺3 mg/kg体重),每组10只,给药后禁食不禁水24 h后麻醉,采用BL-420S生物机能实验系统测定各组大鼠0、5、15、30、45、60 min时胃收缩频率和胃收缩幅度。
1.4.2 小鼠胃动力实验[5-6]取70只KM小鼠,随机分为空白对照组(纯化水)、模型组(纯化水),安胃疡低、中、高剂量组(安胃疡胶囊164、328、656 mg/kg体重),胃乃安组(胃乃安740 mg/kg体重),甲氧氯普胺组(甲氧氯普胺6 mg/kg体重),每组10只,给药3 d后,各组皮下注射硫酸阿托品5 mg/kg体重(空白对照组除外)15 min后,灌胃给予含活性炭末的羧甲基纤维素钠(CMC-Na)黑色半固体糊0.8 mL/只,取胃称全重和净重,计算胃内残留率,胃内残留率=(胃全重-胃净重)/所灌半固体糊的重量×100%。
1.4.3 大鼠胃液分泌实验 取60只SD大鼠,随机分为空白对照组(纯化水)、安胃疡低、中、高剂量组(安胃疡胶囊82、164、328 mg/kg体重)、胃乃安组(胃乃安370 mg/kg体重)、甲氧氯普胺组(甲氧氯普胺3 mg/kg体重),连续给药7 d后,禁食不禁水24 h,酸碱滴定法测定胃液酸度(包括游离酸及总酸度),采用胃蛋白酶(PP)试剂盒测定胃液PP活性。
1.4.4 大鼠慢性非萎缩性胃炎模型实验[7-8]取70只SD大鼠,随机分为空白对照组(纯化水)、模型组、安胃疡低、中、高剂量组(安胃疡胶囊82、164、328 mg/kg体重)、胃乃安组(胃乃安370 mg/kg体重)、甲氧氯普胺组(甲氧氯普胺3 mg/kg体重),每组10只。空白对照组自由饮食,其余各组自由饮用氨水(第1～6周0.05%氨水、第7～12周0.1%氨水),每天灌服2 mL脱氧胆酸钠(20 mmoL/L),每间隔3 d空腹灌服2 mL60%乙醇,2 d足量喂食饲料,1 d禁食,连续12周后,空白对照组和模型组给予同体积纯化水,其他各组给予相应的药物,连续30 d,禁食不禁水24 h后,大鼠腹主动脉取血,4℃下3 500 r/min离心15 min,取血清,采用酶联免疫试剂盒(ELISA法)测定血清IL-8、MTL、GAS水平。取全胃,量取胃液量,用pH计测定胃液pH值,酸碱滴定法测定胃液酸度,胃蛋白酶(PP)试剂盒测定胃液PP活性[9-10]。用预冷的磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.4)固定胃组织15 min,沿胃大弯剪开,肉眼观察胃粘膜损伤情况并进行评分,计算胃粘膜损伤指数[11]。取PBS固定的胃组织,用预冷生理盐水进行匀浆(1∶9),4℃下3 000 r/min离心15 min,取上清液,采用酶联免疫试剂盒测定IL-1β、PGE2水平。用10 %中性甲醛固定胃组织,常规石蜡包埋切片,用苏木素-伊红(HE)染色,显微镜下观察胃组织学情况,进行半定量评分;用阿利新蓝-糖蛋白结合法(AB-PAS)染色,显微镜下观察评价胃粘膜上皮细胞功能。
2.1 安胃疡胶囊对大鼠胃收缩频率及收缩幅度的影响与空白对照组比较,安胃疡低、中、高剂量组、胃乃安组和甲氧氯普胺组胃收缩频率及收缩幅度差异均无统计学意义(P>0.05),见表1、2。
表1 安胃疡胶囊对大鼠胃收缩频率的影响
表2 安胃疡胶囊对大鼠胃收缩幅度的影响
2.2 安胃疡胶囊对小鼠胃动力的影响与空白对照组比较,模型组小鼠胃内残留率升高,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,安胃疡中、高剂量组胃内残留率降低,差异有统计学意义(P<0.05);与胃乃安组、甲氧氯普胺组比较,安胃疡高剂量组胃内残留率无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05),见表3。
表3 安胃疡胶囊对小鼠胃动力的影响
2.3 安胃疡胶囊对正常大鼠胃液指标的影响与空白对照组比较,安胃疡低、中、高剂量组、胃乃安组、甲氧氯普胺组胃液量、胃液酸度(包括游离酸及总酸度)、胃蛋白酶活性差异均无统计学意义(P>0.05),见表4。
表4 安胃疡胶囊对正常大鼠胃液指标的影响
2.4 安胃疡胶囊对慢性非萎缩性胃炎大鼠胃液指标的影响与空白对照组比较,模型组胃液量、胃液酸度、pH值、胃液PP升高,差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较,安胃疡高剂量组和甲氧氯普胺组胃液量降低;安胃疡低、中、高剂量组、胃乃安组、甲氧氯普胺组PP降低;安胃疡中、高剂量组、甲氧氯普胺组pH值降低;安胃疡高剂量组、胃乃安组、甲氧氯普胺组游离酸降低;安胃疡中、高剂量组、胃乃安组、甲氧氯普胺组总酸度含量降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与甲氧氯普胺组比较,安胃疡高剂量组胃液量、pH值差异无统计学意义(P>0.05);与胃乃安组、甲氧氯普胺组比较,安胃疡中剂量组总酸度差异无统计学意义(P>0.05),见表5。
表5 安胃疡胶囊对慢性非萎缩性胃炎大鼠胃液指标的影响
2.5 安胃疡胶囊对慢性非萎缩性胃炎大鼠胃粘膜损伤的影响与空白对照组比较,模型组大鼠胃壁充血水肿,色淡,表面粗糙,凹凸不平,有散在斑点或条状出血,胃粘膜损伤指数升高,差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组大鼠比较,安胃疡高剂量组、甲氧氯普胺组大鼠胃组织明显改善,胃壁表面较光滑,色泽淡红,胃壁略有增厚,胃粘膜损伤指数降低,差异有统计学意义(P<0.05),见表6。
表6 安胃疡胶囊对慢性非萎缩性胃炎大鼠胃粘膜损伤指数的影响
2.6 安胃疡胶囊对慢性非萎缩性胃炎大鼠胃组织病理学影响与空白对照组比较,模型组大鼠胃组织中度充血,出血伴轻度上皮细胞坏死脱落,胃组织病理学检查评分升高,差异有统计学意义(P<0.01);胃黏膜腺体萎缩,不规则,腺体稀疏,胃黏膜上皮细胞粘蛋白指数、酸性粘蛋白指数降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,安胃疡低、中、高剂量组、胃乃安组和甲氧氯普胺组胃组织病理学检查评分降低,差异有统计学意义(P<0.05);安胃疡中、高剂量组、胃乃安组和甲氧氯普胺组胃黏膜上皮细胞粘蛋白指数升高,差异有统计学意义(P<0.05),安胃疡中剂量组胃粘膜酸性粘蛋白指数升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与胃乃安组比较,安胃疡中、高剂量组胃组织病理学检查评分与胃黏膜上皮细胞粘蛋白指数差异均无统计学意义(P>0.05),见图1、2,表7。
图1 各组大鼠胃组织染色图(HE,×400)
图2 各组大鼠胃黏膜上皮细胞染色图(AB-PAS,×100)
表7 安胃疡胶囊对慢性非萎缩性胃炎大鼠胃组织病理学的影响
2.7 安胃疡胶囊对慢性非萎缩性胃炎大鼠血清IL-8、MTL、GAS水平的影响与空白对照组比较,模型组IL-8、GAS升高,MTL降低,差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较,安胃疡低、中、高剂量组、胃乃安组和甲氧氯普胺组IL-8降低;安胃疡中、高剂量组、胃乃安组和甲氧氯普胺组GAS降低,MTL升高,差异有统计学意义(P<0.01)。与胃乃安组比较,安胃疡中、高剂量组IL-8、 MTL无明显变化,与甲氧氯普胺组比较,安胃疡中、高剂量组GAS变化不大,差异均无统计学意义(P>0.05),见图3。
2.8 安胃疡胶囊对慢性非萎缩性胃炎大鼠胃组织IL-1β、PGE2水平的影响与空白对照组比较,模型组IL-1β升高,PGE2降低,差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较,安胃疡中剂量组IL-1β降低,差异有统计学意义(P<0.05),安胃疡高剂量组、胃乃安组和甲氧氯普胺组IL-1β降低,差异有统计学意义(P<0.01);安胃疡低、中、高剂量组PGE2升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与胃乃安组和甲氧氯普胺组比较,安胃疡高剂量组PGE2差异无统计学意义(P>0.05),见图4。
注:与空白对照组比较, *P<0.05, **P<0.01; 与模型组比较, #P<0.05, ##P<0.01。图4 安胃疡胶囊对慢性非萎缩性胃炎大鼠胃组织IL-1β、PGE2水平的影响
本研究通过测定给药前后正常小鼠及胃动力不足小鼠的胃内残留率,发现安胃疡胶囊具有调节胃动力作用。GAS是影响胃酸分泌及幽门括约肌松弛的主要激素介质,GAS过度释放,可造成胃液酸度、胃液PP活性增加,刺激胃肠道运动的MTL水平降低,导致胃黏膜损伤[12]。本研究发现安胃疡胶囊通过调节慢性非萎缩性胃炎大鼠胃肠激素水平,减少胃酸分泌,降低胃液酸度,进而降低胃蛋白酶活性,减轻对胃粘膜的损伤。通过观察胃黏膜损伤及胃组织病理学变化,测定与机体炎症程度呈正相关的IL-1β、IL-8水平和对胃粘膜起重要保护作用的PGE2[13-14],发现安胃疡胶囊对慢性非萎缩性胃炎模型动物炎症的抑制,及对粘膜的保护、修复作用,与抑制IL-1β、IL-8表达,提高体内PGE 2水平密切相关。本次研究为后续安胃疡胶囊改良型新药的研发提供了理论基础。
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