杨凡，刘明智，栾会妮，廖传松，王佳成，冯广朋，蒋日进，徐汉祥
(1.浙江海洋大学海洋与渔业研究所，浙江省海洋水产研究所，农业农村部重点渔场渔业资源科学观测试验站，浙江省海洋渔业资源可持续利用技术研究重点实验室，浙江舟山 316021；
2.威海海洋职业学院，山东荣成 264300；
3.中国科学院水生生物研究所，湖北武汉 430072；
4.中国水产科学研究院东海水产研究所，上海 200090)
生物体的形态特征在不同环境下表现不同，这通常是生物体对生活环境长期适应的结果[1]。目前，有关生物体形态学的差异性与环境的相互关系已然成为生物学界研究的热点话题之一[2-3]。对水生动物而言，耳石形态常用于不同种群间的比较研究，如东太平洋不同海区茎柔鱼Dosidicus gigas耳石形态及生长研究[4]，嘉陵江不同流域蛇鮈Saurogobio dabryi耳石形态特征及差异等[5]。这些研究都在尝试解释耳石形态与环境相互适应的关系。鱼类耳石形态特征通常取决于多种因素，如遗传、环境因素等。在特定的水域环境条件下，同一种鱼类耳石形态特征因其相同的环境条件和生境履历特征而表现出较高的同质性[6]，而在不同水域环境，为了更好地适应不同水温、水流速度等环境因素其耳石形态则会表现出异质性[5]。
耳石作为一种硬骨鱼类最早钙化的组织，记录着鱼类的年龄以及生活环境等相关信息，常用来鉴定鱼类年龄[7]和重塑鱼类生活史[8]等。近些年来，如许氏平鲉Sebastes schlegelii、弧带鹦嘴鱼Scarus dimidiatus耳石形态特征被国内外学者用作群体划分的依据[9-10]。通常认为，在群体识别与划分研究中，相较于星耳石和微耳石，矢耳石更适合[11]。目前常用于表征耳石形态的参数主要有2 种：耳石尺寸参数和耳石形状指标，前者通常是对耳石进行几何测量如：长、宽、周长、面积和质量等；
后者是通过耳石大小变量经过数学转换来表征耳石形状的某一方面信息，如形态因子，矩形趋近率、面密度等。尺寸参数与形状指标的结合能更好地表征不同种类的耳石特征，从而能更好地划分不同群体。
近些年来，耳石形态在长江中下游、长江口以及邻近海域鲚属鱼类如刀鲚Coilia nasus、短颌鲚C.brachygnathus和湖鲚C.ectenestaihuensis的研究中已取得一定的进展。这些研究通常采用框架法和地标点法的手段对不同鱼类的耳石形态特征进行比较[12-13]，这些分析方法易受人为因素影响，无法准确全面地反映耳石形态的真实情况，但耳石的尺寸参数与形状指标可以较好地反映耳石形态特征，此外根据耳石尺寸参数和形状指标进行差异系数检验、均数差异显著性检验等一系列分析可以有效地识别物种有效性，鉴别近缘种。这在湖鲚物种有效性等方面已经有一定研究[14]，但是对于争议较大的短颌鲚物种有效性却未见报道。为此，本研究以楠溪江、瓯江、香溪河水域的3 种鲚属鱼类：刀鲚、凤鲚C.mystus和短颌鲚为研究对象，利用耳石尺寸参数和形状指标划分不同群体。一方面以期能更好地表征耳石形态，为鲚属鱼类的群体划分提供科学的参考，另一方面丰富不同流域鲚属鱼类耳石形态学数据，为更好地区分和保护不同区域鲚属鱼类提供新途径。
1.1 实验材料
本研究共采集98 尾鲚属鱼类。其中刀鲚32 尾，来自永嘉楠溪江；
凤鲚31 尾，来自温州瓯江；
短颌鲚35 尾，来自秭归香溪河。具体信息如表1 所示。样本经过冷冻保存后，送回实验室进行生物学测定(体长、体质量)。
表1 刀鲚、凤鲚和短颌鲚的采样信息Tab.1 Sampling information for C.nasus, C.mystus and C.brachygnathus
1.2 耳石处理
取出样本的1 对矢耳石，分别装入离心管内并用蒸馏水浸泡1 h，后在JP-030 型超声波清洗机(深圳洁盟，中国)中洗涤30 min，除去耳石黏液与杂质。清洗结束后，按照标号顺序依次置于培养皿内，室温下干燥。
1.3 耳石形态学参数与形态指标
刀鲚耳石形态学参数包括耳石尺寸参数和形状指标。尺寸参数利用Mettler Toledo PL403 电子天平(梅特勒托利多，瑞士)对耳石进行称重(精确至0.000 1 g)。利用Nikon SMZ-2000 解剖显微镜(尼康，日本)对左、右矢耳石拍照，如图1 所示，利用Image-Pro Plus 6.0 软件测量耳石形态学参数(精确至1 mm)；
形状指标利用尺寸参数计算得出，如表2 所示。
图1 3 种鲚属鱼类矢耳石照片Fig.1 The sagittal otolith of three Coilia spp.
表2 鲚属鱼类耳石尺寸参数与形状指标Tab.2 Size dimension parameters and shape indices of otolith used to describe the three Coilia spp.
A1：面密度(surface density)：耳石单位面积的质量。表征耳石的薄厚程度，可以反映耳石的三维特征；
A2：环率(circularity)：耳石周长与耳石面积平方的比值；
A3：椭圆率(ellipticity)：耳石长与宽的差与和的比值，指的是外缘点到长轴的距离的比例；
A4：圆度(roundness)：耳石横截面接近圆的程度，环率与圆度表征耳石趋近于圆的程度，二者呈负相关；
A5：幅形比(aspect ratio)：耳石长与耳石宽的比值，表征耳石轴间的差异程度；
A6：矩形趋近率(rectangularity)：耳石面积与其最小外切矩形面积的比值，描述了耳石轮廓与耳石最小外接矩形的关系；
A7：形态因子(form-factor)：4 倍耳石面积和圆周率的乘积与耳石周长平方的比值，反映耳石轮廓的规则程度[15]。上述耳石形状指标在一定程度上可以避免耳石形态分析误差，如耳石大小、形状等客观因素。
1.4 数据分析
对左右耳石尺寸参数和耳石形状指标分别进行差异系数检验、均数差异显著性检验和配对样本t检验，对7 个形态指标分别进行主成分分析和判别分析。
(1) 差异系数检验
差异系数(C.D)：用于检验群体间某一相同性状的差异程度，通常用于区分亚种。根据MAYR,et al[16]提出的识别和划分亚种的75%规则，公式如下：
式中：M1和M2为2 个群体某一相同形态性状平均值；
S1和S2为对应标准差；
C.D 为判断亚种和种水平的临界值，大于临界值(1.28)差异性达到亚种水平，相反则属于种间差异。
(2)均数差异显著性检验
均数差异显著性(Mdiff)：分析群体间某一相同性状的差异程度的t检验方法。公式如下[17]：
式中：ni和nj为群体样本数；
Mi和Mj为某一性状平均值；
mi和mj为对应性状的标准误差；
概率水准为P=0.05，以t＞2.58 为差异显著的检验标准。
(3)配对样本t检验
分析左右耳石尺寸参数和耳石形状指标，以检验左右耳石是否存在差异。
(4)主成分分析
计算形态指标特征值，选择大于1 的主成分因子。利用第一、二主成分得分绘制成分载荷图。
(5)判别分析
根据Fisher’s 准则[17]对耳石形状指标进行逐步判别分析，建立3 种鲚属鱼类的线性判别函数方程，以便查明样本的归属情况。
上述所有分析运用SPSS 24.0 软件，制图使用Origin 2022 软件。
2.1 差异系数检验
差异系数检验如表3 所示，刀鲚和短颌鲚的7 个耳石尺寸参数在2 个种间的差异系数均小于1.28，根据MAYR,et al[16]的规则判定刀鲚与短颌鲚在耳石形态上的差异未达亚种水平，二者为同种下的不同生态型群体。
表3 刀鲚和短颌鲚耳石尺寸参数的差异系数和均数差异显著性Tab.3 Mdiff and C.D of otolith measurement characteristic of C.nasus,and C.brachygnathus
2.2 均数差异显著性检验
通过对刀鲚和短颌鲚耳石的7 个尺寸参数的均数差异显著性检验，发现仅耳石周长的均数差异显著性值小于2.58，其余的6 个参数均数差异显著性值均大于2.58。均数差异显著性比例非常高，说明具有不同生活史的2 种鲚属鱼类在耳石形态方面已经存在明显的种群差异特征。由于凤鲚的分类地位较为明确，是单独的物种。因此本文仅研究刀鲚与短颌鲚的差异系数与均数差异显著性检验。
2.3 配对样本t 检验
3 种鲚属鱼(以刀鲚为例，如表4 所示)的左右矢耳石参数与指标差异均不显著(配对样本t检验，P＞0.05)。因此，统一使用左耳石进行数据分析，若出现左耳石破损可用右耳石替代。
表4 刀鲚左右矢耳石的差异性分析Tab.4 The analysis of t-test for the left and right sagittae of C.nasus
2.4 主成分分析
主成分分析结果如表5 所示，3 种鱼类中均有2 个形状指标的特征值大于1，分别记作第一主成分和第二主成分。第一主成分分别解释了约49%、44%、49%的变量信息。刀鲚的第一主成分中A4、A6具有较高的正载荷，A2、A7的载荷量较低；
凤鲚的第一主成分中A3、A5具有较高的正载荷，A2、A7的载荷量较低；
短颌鲚的第一主成分中A1、A6具有较高的正载荷，A4的载荷量较低；
第二主成分中，刀鲚的A1、凤鲚的A3、A7、短颌鲚的A3、A5有着较高的载荷量，他们与第一主成分分别解释了78%、81%和90%的变量信息。前2 个主成分散点图显示：3 个种群分布在4 个象限内，这种分布表现出一定的随机性，各个群体之间存在明显的交叉现象(图2)。
图2 3 种鲚属鱼类耳石形状指标第一、二主成分分析散点图Fig.2 Scatter plot scores based on the first two principal components for otolith shape indices of three Coilia spp.
表5 3 种鲚属鱼类耳石形状指标主成分分析结果Tab.5 The result of principal component analysis for otolith shape indices of three Coilia spp.
2.5 判别分析
将3 种鲚属鱼类的7 种耳石形态指标数据输入SPSS 软件，利用逐步判别分析得到3 个耳石形状指标(A1、A2、A7)，将这3 个形态指标纳入判别分析的方程：
将各个体的耳石形状指标依次代入以上3 个判别方程，每个个体得到3 个函数值，最大的函数值对应的判别函数表示的群体即为该个体所属的群体。判别结果如表6 所示，可以看出判别正确率在90.3%～100%之间，综合判别正确率为93.8%。
表6 3 种鲚鱼判别分析结果Tab.6 Discriminant result of three Coilia spp.
图3 是基于前2 个判别函数值绘制的散点图，3 个群体之间各自呈区域性聚集，凤鲚和短颌鲚有少部分重叠，刀鲚为单独聚类。
图3 判别函数散点图Fig.3 Scatter plot based on the first two discriminant functions
3.1 矢耳石形态指标识别刀鲚和短颌鲚物种地位的有效性
目前，对于短颌鲚的物种地位有效性存在很大争议。短颌鲚最早被KREYENBERG 和PAPPENHEIM于1908 年确定为1 个物种，因其上颌骨和生活环境等特征不同于其他鲚属鱼类，因此被视为一个有效种[18]。但随着调查的深入，在一些江湖连通的水域中也发现了短颌鲚的踪影，上颌骨这一明显鉴别刀鲚和短颌鲚的特征变得模糊，一时间对于短颌鲚物种有效性引起了许多学者的广泛讨论[19]。目前关于这二者的分类地位存在不同观点：在21 世纪初期，许多研究认为短颌鲚物种地位是无效的，唐文乔等[20]基于线粒体控制区全序列计算短颌鲚与刀鲚之间平均K2-P 遗传距离仅为0.017，认为短颌鲚是刀鲚的淡水生态型群体。周晓犊等[21]利用线粒体COⅠ基因作为DNA 条形码，再次证明了短颌鲚未达到种或亚种的分化水平。近几年，XUAN Zhongya,et al[22]利用分子生物学与耳石微化学学科相结合的手段，对刀鲚与短颌鲚进行了群体遗传分析，认为二者应作为2 个独立的鲚属鱼类，这与本世纪初其他研究结果不同。本文利用差异系数检验分析刀鲚与短颌鲚耳石形态特征，根据MAYR,et al[16]的差异系数计算法则，所检验的7 个参数均小于1.28，表明刀鲚与短颌鲚之间的差异并未达到亚种水平，支持2 种鱼类为同一物种的结论。均数差异显著性检验结果显示二者在耳石形态方面存在较大的差异。从结果不难看出，刀鲚与短颌鲚之间分化水平较低，由于长期生活在不同的水域环境中，导致不同耳石形态有明显的种群差异性。在不同鱼类群体之间，耳石形态特征主要由遗传因素决定[23]，此外耳石形态还受到环境异质性等因素的影响，这一点在大西洋鳕Gadus morhua身上得到了很好的验证，水温对其耳石形态方面起到了重要的作用[24]。不同水域间，水体环境往往存在一定的差异。本文所研究的刀鲚和短颌鲚分别采自楠溪江与香溪河。楠溪江位于瓯江下游，与瓯江水体交换频繁，并与东海连通；
而香溪河是三峡库区一级支流中距离三峡大坝最近的河流。三峡大坝竣工后，香溪河水体与长江水体交换速度缓慢。两地存在巨大的地理差异，这也就造成二者耳石均数差异显著，耳石形态存在明显差异。这也再次证明不同水域环境对鱼类耳石形态有着较大的影响。
3.2 3 种鲚属鱼类矢耳石多元统计分析比较
利用3 种鲚属鱼类耳石尺寸参数与形状指标分别进行配对t检验，结果表明左右耳石各项指标差异均不显著(P＞0.05)，再次验证我国鲚属鱼类左右矢耳石无显著性差异[25]。基于左右矢耳石可替代性、个体大、易于观察等优势，其可靠性已然成为物种特征形态学分析的有利工具[26]。主成分分析可以较好地筛选重要变量，降低遗漏重要变量的风险，简化分析统计过程[27]。本文主成分分析结果的累计贡献率较好地解释了总变异。在主成分分析散点图中，3 种鱼类耳石样本相互交织在一起，进一步结合判别分析散点图，可以较好地利用耳石形态区分3 种不同群体，显示这3 种鱼在耳石方面存在较大的区别，这也与上述结论相符合。在判别分析中，筛选得到A1(面密度)、A2(环率)、A7(形态因子)3 个形状指标，这些指标可以作为今后开展鲚属鱼类耳石形态分析的主要候选指标，可以较大程度提高群体识别能力。此外，判别分析的综合正确率为93.8%，证明耳石形态学是有效地识别这3 种鱼的方法。因此，利用耳石形态学鉴别不同群体时，应尽可能地多收集样本的大小变量(周长、直径、面积等)和形状指标(形态因子、椭圆率等)，综合2 种角度对群体的识别效果更好[6]。在鱼类群体识别中，除了运用种群生态学分析法如形态学法、生活史特征分析、寄生虫标志法等，还常见到种群遗传分析和耳石信息分析的方法。遗传分析对于生活史高度重叠、遗传差异性较小的鱼类时，其鉴别效果会大打折扣。而耳石作为一种特异性高、群系特异性显著的生物标志物[28]，用于区分鱼类群体优势(易于保存、受到外界影响小等)更加明显。将不同的耳石信息分析方法相结合，能更好地划分不同的鱼类群体[29-30]。相信随着耳石形态学研究工作的进一步深入，其在渔业资源相关领域的研究中会起到越来越重要的作用。
3.3 我国鲚属鱼类的分类
目前，我国鲚属鱼类包括刀鲚、凤鲚、七丝鲚C.grayi3 种，这一观点得到了绝大多数学者的支持[31-39]。凤鲚在鲚属鱼类中，处于系统发育较为原始的位置，刀鲚和七丝鲚分别为适应寒冷与温暖性气候的分化的物种[20]。短颌鲚与湖鲚分别为刀鲚的2 个不同生态型群体，随着时间的推移，在地理格局与水体环境等因素的综合影响下，不排除短颌鲚与湖鲚分化为亚种的可能。如表7 所示，在鲚属鱼类的研究中，过去往往集中于长江中下游至长江口及其周围湖泊水域，东海区也有部分研究，长江上游流域刀鲚耳石形态暂无报道。长江中上游有许多大型水利设施，形成天然的地理隔离，这些水利枢纽可能阻碍了上游与下游流域鱼类基因的交流；
相较于上游，中下游流域大型水利设施较少，鱼类基因交流较为频繁，中上游的短颌鲚群体保留了较为原始的鲚属鱼类特征，这可能是本研究与XUAN Zhongya,et al[22]研究结果不一致的原因。
表7 中国鲚属鱼类分类的研究现状Tab.7 The research status of Coilia spp.classification in China
综上所述，由于本文仅利用耳石形态对鲚属鱼类进行种间识别并对物种有效性进行分析，在讨论鲚属鱼类种间识别与物种有效性问题时可能存在一些短板，今后应结合分子生物学等手段，对耳石形态学得出的相关结论进行验证，进一步判断耳石形态学在种间识别等问题研究中的科学性。此外，本文对短颌鲚物种进行有效性分析时，短颌鲚样品收集仅选择在长江上游(秭归香溪河)，并未采集长江中游与下游流域的样品，因此在讨论物种有效性时，应丰富不同流域的样本，因地制宜地对不同流域的种类分别进行讨论，综合研判，以此确定其有效地位。
致谢：本研究在耳石的形态学测量、照片拍摄等方面得到了自然资源部第二海洋研究所毛琴同学的大力帮助，特表谢忱！
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