颜少宾,周 平,郭 瑞,金 光
(福建省农业科学院果树研究所/福建省落叶果树工程技术研究中心,福州,350001)
桃是蔷薇科李属桃亚属的多年生落叶果树,对需冷量要求严格。近年来,低纬度地区暖冬现象越来越明显,桃因需冷量不足易导致花芽枯萎严重、花期延迟、开花不整齐等问题[1],甚至只萌芽不开花,直接影响桃树的生长发育和经济效益。人工辅助破眠作为一种技术手段,能打破休眠,促进萌芽。目前,根据作用方式,人工辅助破眠主要有物理、化学、植物生长调节剂等3种破眠方式。植物生长调节剂TDZ处理后,桃萌芽所需的时间要比单氰胺和高温处理长,其作用主要是促进芽萌发而非打破休眠[2];50 ℃高温物理破眠对桃芽的伤害小、破眠效果显著,但要求田间配有高温制热设施,难以在生产果园中推广应用;化学药剂破眠使用简便、易操作。因此,生产果园多以化学药剂辅助破眠为主。
化学破眠剂主要有单氰胺、硫脲、二硝基邻甲酚、叠氮化钠等。二硝基邻甲酚破眠效果虽好,但对环境污染严重,已被禁用;硫脲仅对中、长需冷量观赏桃有破眠效果,存在一定的破眠局限[3];叠氮化钠发挥的是诱变作用而非破眠[4]。其他化学药剂如KNO3,一般需要与其他药剂配合使用,才能显现出破眠效果。单氰胺(CH2N2)又名氨基氰[5],在多种化学破眠药剂中破眠效果突出[6],在苹果[7]、葡萄[8-11]、冬枣[12]、樱桃[13-14]、猕猴桃[15]、蓝莓[16-17]等果树上使用广泛,不同品种和浓度的作用效果存在明显差异。单氰胺还能提升葡萄果实品质[9-10]及着果率[11,18],但迄今为止,对单氰胺处理后果树花器发育的研究甚少,需要进一步完善。本文拟研究单氰胺对桃花开放的影响,分析不同浓度单氰胺处理条件下桃花芽萌发、花粉发育的变化规律,确定最佳浓度,以期为应对暖冬气候提供参考。
1.1 材料与试剂
试材为福建省建瓯市桃示范基地内(118.35°E,27.11°N,海拔156 m)树体健壮、长势较一致的4年生“红花鹰嘴桃”枝条。“红花鹰嘴桃”树冠较开张,2月下旬始花,花期7～10 d。花蔷薇型,5瓣,鲜红色,花粉多,自花结实率高。果实成熟期7月下旬至8月上旬,平均单果质量268.77 g,最大可达338.62 g。果肉硬、脆甜,风味浓,耐贮运。
主要试剂:二甲苯(国药集团化学试剂有限公司)、无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司)、FAA固定液(45%乙醇+6%冰醋酸+5%福尔马林)、HE染液套装(Servicebio,G1003)、中性树胶(国药集团化学试剂有限公司)、荣芽(宁夏大荣化工冶金有限公司,单氰胺50%水剂)。
1.2 试验器材
脱水机(DIAPATH,Donatello)、包埋机(武汉俊杰电子有限公司,JB-P5)、冻台(武汉俊杰电子有限公司,JB-L5)、病理切片机(上海莱卡仪器有限公司,RM2016)、组织摊片机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司,KD-P)、烤箱(天津市莱玻瑞仪器设备有限公司,GFL-230)、防脱载玻片(Servicebio,G6004)、正置光学显微镜(日本尼康,Nikon Eclipse E100)、成像系统(日本尼康,NIKON DS-U3)。
1.3 试验方法
2021年11月27日(11月平均高温18 ℃,平均低温10 ℃)即“红花鹰嘴桃”自然落叶后低温累积开始前,剪取粗细较相近的中果枝(长30±2 cm)300条带回实验室,将枝条下端剪成斜口[19],随机分成Ⅰ组、Ⅱ组。每组随机分成5个处理(CK、T1、T2、T3、T4),每个处理10根枝条,采用不同浓度单氰胺处理,每个处理重复3次。按图1进行处理后于室内进行清水水培瓶插,室内环境(16±2)℃、自然光、湿度(78±3)%,瓶插水位5 cm左右,每隔1 d换1次水[20]。
其中,Ⅰ组在4 ℃低温休眠过程中需采用报纸保湿,保证枝条湿度。
图1 “红花鹰嘴桃”单氰胺处理方法
1.4 测定指标
1.4.1 物候期观察 2021年11月27日开始观察记录“红花鹰嘴桃”枝条水培瓶插生长情况,每天观察1次,参考《桃种质资源描述规范和数据标准》[21]、《观赏桃》[22]进行记录。
1.4.2 花粉萌发率 采集“红花鹰嘴桃”大蕾期花药,用干燥剂干燥后散播于固体培养基(10%蔗糖+1%琼脂+0.01%硼酸)上[23],在25 ℃人工气候培养箱进行暗培养,统计3 h花粉萌发率[24]。每处理观察5个视野,每视野花粉粒数量不少于20个,重复3次[25]。
花粉萌发率(%)=已萌发花粉粒总数/花粉粒总数×100。采用SPSS 24.0、Excel软件对数据进行统计分析。
1.4.3 花器切片 石蜡切片。采集大蕾期花药,FAA固定液固定24 h以上,取出花药放于脱水盒内,放进脱水机内依次梯度酒精进行脱水。方法参考冯丽云等[26]的方法,即75%酒精4 h,85%酒精2 h,90%酒精2 h,95%酒精1 h,无水乙醇I 30 min,无水乙醇II 30 min,醇苯5～10 min,二甲苯I 5～10 min,二甲苯II 5～10 min,65 ℃融化石蜡I 1 h,65 ℃融化石蜡II 1 h,65 ℃融化石蜡III 1 h。将浸好蜡的花药于包埋机内进行包埋,于-20 ℃冻台冷却。蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出置于石蜡切片机切片,厚4 μm。切片漂浮于摊片机40 ℃温水上将组织展平,载玻片将组织捞起,60 ℃烘箱内烤片。水烤干蜡烤化后取出常温保存备用。
染色封片。依次将切片放入二甲苯Ⅰ 20 min-二甲苯Ⅱ 20 min-无水乙醇Ⅰ 5 min-无水乙醇Ⅱ 5 min-75%酒精5 min,自来水洗。切片入苏木素染液染3～5 min,自来水洗,分化液分化,自来水洗,返蓝液返蓝,流水冲洗。切片依次入85%、95%的梯度酒精脱水各5 min,入伊红染液中染色5 min。切片依次放入无水乙醇I 5 min-无水乙醇II 5 min-无水乙醇Ⅲ 5min-二甲苯Ⅰ 5 min-二甲苯Ⅱ 5 min透明,中性树胶封片。
图像采集分析。正置光学显微镜镜检,3DHISTECH’s Slide Converter软件分析。
2.1 对“红花鹰嘴桃”萌芽、开花的影响
两个组别所有处理的叶芽均可萌发,T1、T2、T3处理均能观察到花芽膨大后开花(图2)。在水培试验过程中,完整观察到芽休眠(图3a)、叶芽萌发(图3b)、展叶(图3c)、花芽膨大至露红(图3e)、花苞(图3f)、开花(图3g)等叶芽、花芽生长发育过程。T4处理的单氰胺浓度太高,花芽稍膨大即脱落(图3h),出现枝梢干枯、芽坏死(图3d)。
注:a.休眠芽,b.露芽,c.展叶,d.枝梢顶端干枯,e.露红,f.花苞,g.花期,h.花芽膨大后脱落。
针对不同低温积累条件下的单氰胺处理效果进行分析,发现Ⅰ组(400 h低温积累)所有处理的叶芽、花芽均能萌发;且单氰胺处理对叶芽萌发、开花时间的影响总体呈促早趋势,但促早天数波动较小。即叶芽萌发时间T1处理尚无提前,T2、T3、T4处理提前3 d左右;首花开放时间提前2～4 d,花朵集中开放,花期较短(见表1)。而Ⅱ组(0 h低温积累)CK枝条叶芽可萌发但花芽不能萌发;经单氰胺(0.5%～1.0%)处理后,相应处理组枝条花芽均能膨大并开花,且处理浓度越高,首花开放和叶芽萌发所需的天数越少。比较叶芽萌发,T1处理较CK提前6 d,T2、T3、T4处理较CK提前13 d左右。上述结果说明足量低温的累积是保证桃正常开花的首要条件;当低温累积为0时,单氰胺处理(0.5%～1.0%)对桃叶芽、花芽解除休眠有积极效应。
表1 单氰胺处理对“红花鹰嘴桃”萌芽、开花的影响
2.2 对“红花鹰嘴桃”花粉萌发率的影响
T4处理花芽脱落及Ⅱ组CK未开花,均未能收集花粉,故其花粉萌发率以0统计。
花粉萌发试验发现,Ⅰ组不同处理间不存在统计学差异水平(图4),各处理的花粉萌发率基本相同,说明单氰胺处理对4 ℃低温休眠400 h“红花鹰嘴桃”的花粉萌发率没有显著影响,单氰胺处理不干扰花粉发育。Ⅱ组“红花鹰嘴桃”花粉萌发率随单氰胺处理浓度升高而逐步增加,T3处理时达到最大值,即花粉萌发率可最高提升至27%,但仍低于Ⅰ组(400 h低温积累)CK的60.38%。以上结果表明,足量的低温累积是促进花粉正常发育保障花粉萌发率的必要条件,而使用单氰胺(0.5%～1.0%)解除花芽休眠促进成花后能部分消减低温累积不足对花粉发育的负面影响。
注:Ⅰ、Ⅱ组的T4处理及Ⅰ组CK花芽未萌发,未统计到花粉萌发率,即为0;a、b、c、d表示差异显著(p<0.05)。
2.3 对“红花鹰嘴桃”花药的影响
在低温累积不足的情况下,单氰胺处理能提高花粉萌发率,但其最高萌发率(27%)达不到低温休眠400 h“红花鹰嘴桃”花粉萌发率(60.38%)的一半(图4)。显微观察二者花药花粉发育情况,结果显示,“红花鹰嘴桃”花药呈蝴蝶形,低温休眠400 h“红花鹰嘴桃”(图5中Ⅰ组CK)异常花粉比例较低,低温累积不足的“红花鹰嘴桃”经单氰胺处理开花后其异常花粉比例相对较高(图5 Ⅱ组T1、T2、T3)。说明在无低温积累时单氰胺处理成花可以获得成熟花粉,但异常花粉比例偏高。
a:正常花粉;b:异常花粉
需冷量是指植物解除内休眠所需的有效低温时数或单位数。“红花鹰嘴桃”经4 ℃低温休眠400 h,花芽可膨大后正常开花,且花粉具有较高的萌发率,说明4 ℃低温休眠400 h基本满足“红花鹰嘴桃”的需冷量。未经低温休眠的“红花鹰嘴桃”花芽未见膨大,经4 ℃低温休眠400 h的“红花鹰嘴桃”花芽膨大后能正常开花,说明足量低温的累积是保证桃正常开花的首要条件,桃叶芽、花芽只有满足了需冷量才能解除自然休眠、获得理想的营养生长和最佳的果实承载能力[27]。此外,在低温累积不足的情况下,单氰胺(0.5%～1.0%)能促进“红花鹰嘴桃”叶芽提前6～13 d萌发,促使花芽膨大后开花,花粉萌发率提升至27%,说明单氰胺(0.5%～1.0%)对桃叶芽、花芽解除自然休眠有积极效应,能部分消减低温累积不足对桃解除休眠后花粉发育的负面影响,这可能是单氰胺处理在一定条件下使用能提高果实着果率的一个主要原因;花药石蜡切片结果也进一步证实低温积累不足时单氰胺处理可以获得低比例正常花粉,但远不及满足400 h低温积累的花药中正常花粉的比例,说明足量低温积累才是解除休眠后花粉正常发育的前期必要条件[28]。
目前,单氰胺打破休眠的途径说法不一,单氰胺处理后芽内过氧化氢酶表达受抑制、活性下降[29],芽内过氧化氢积累,过氧化氢可能通过调节 Ca2+信号调控自然休眠。单氰胺处理后对电子传递的细胞色素途径产生抑制,电子传递链的抑制可能起着启动作用[30]。线粒体电子传递紊乱是细胞内过氧化氢产生的重要途径之一,细胞色素途径的抑制可引起电子传递链中电子利用率发生变化,“漏出”电子对氧进行单电子还原后形成活性氧,这种氧化胁迫被认为是自然休眠解除和芽萌发的诱因之一[31]。而单氰胺打破桃芽休眠的具体途径和作用机理尚不够明确,有待进一步深入研究。
本研究采用不同浓度单氰胺喷施“红花鹰嘴桃”离体枝条,能促萌芽期、花期提前,且不同浓度处理和效果存在差异,这与前人的研究结果一致[32-34],说明不同品种不同生长特性所需单氰胺浓度不同。在生产应用上,应根据实际情况,充分考虑品种特性、树体长势、枝条强弱和立地条件,不可盲目加大单氰胺浓度,过高浓度会导致枝条表皮变色、枝梢干枯、芽坏死[2,35](图2-d)。单氰胺破眠不仅可在生产上使用,缓解部分桃品种因冷量累积不足、无法打破休眠、不能正常开花结果的现象,也可应用到育种工作中,缩短杂交父母本花期不遇的时间,加快育种工作进程。此外,本研究是以离体枝条进行水培瓶插,室内环境较稳定,便于排除外界因素干扰利于观察比较,但单氰胺处理后,“红花鹰嘴桃”花色与田间显现的红色相比略浅(图2-g),花形不够端正,不能全面反应单氰胺处理对桃花开放的影响。下一步将开展田间试验,以期获得更为科学、全面、可靠的田间数据,为生产应用提供参考依据。
不同单氰胺浓度对不同低温休眠时长的“红花鹰嘴桃”叶芽、花芽的作用效果存在差异。以1.0%单氰胺处理效果最显著,可促进未经低温休眠的“红花鹰嘴桃”离体枝条叶芽提前13 d萌发,促花芽膨大后开花,花粉萌发率最高提高至27%,促进部分花粉的萌发。表明单氰胺对“红花鹰嘴桃”的叶芽、花芽解除休眠有积极效应,能部分消减无低温休眠对桃解除休眠后花粉发育的不利影响,但不能取代需冷量的满足。
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