夏飞，杜洪桥，曾颜，李玉薇，李家力，卢佳，李新国
武汉生物制品研究所有限责任公司，湖北 武汉 430207
严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory symptom coronavirus 2，SARS-CoV-2）自2019年12 月在全球多地出现后，迅速成为全球重大公共卫生问题，对人类健康和社会经济发展造成重大影响。截至2022年11月18日，世界卫生组织（World Health Organization，WHO）共报告637 129 924 例新型冠状病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019，COVID-19）确诊病例。
随着SARS-CoV-2 的传播，全球范围内已出现大量SARS-CoV-2 变异谱系。其进化和变异趋势可能发生传播能力增强、对中和抗体敏感度降低、发生免疫逃逸［1-4］。其中首先出现的奥密克戎（Omicron）变异株为BA.1［5］，随后Omicron 变异株亚型相继出现，包括BA.1.1、BA.2、BA.3、BA.4、BA.5等，为目前全球SARS-CoV-2 疫情的主要变异株类型。已有研究显示，Omicron 变异株中突变基因Q498R、N501Y可能导致病毒传播性及传染性增强；
突变基因S477N、Q498R、N501Y可能导致S 蛋白与血管紧张素转换酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）受体的结合能力增强［6-8］；
缺失基因H69N70和突变基因T478K、E484A导致毒株免疫逃逸能力增强［2，9］。接种疫苗是全球SARS-CoV-2 疫情防控的有效策略，但现有疫苗对Omicron 变异株的保护效力降低，需针对Omicron变异株进行疫苗研制［2，10-12］。本研究旨在优化BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.5 4种Omicron变异株疫苗候选株在Vero 细胞中的培养条件，为SARS-CoV-2 Omicron变异株疫苗的大规模生产奠定基础。
1.1 细胞及毒株 贴壁培养型Vero 细胞工作细胞库（P134）由本所新发传染病研究室建立并保存；
Omicron 4 种亚型毒株BA.1（编号：WIBP001，代次：P9，滴度：5.25 lgCCID50／mL）、BA.1.1（编号：WIBP007，代次：P13，滴度：5.75 lgCCID50／mL）、BA.2（编号：WIBP004，代次：P13，滴度：6.00 lgCCID50／mL）和BA.5（编号：WIBP013，代次：P11，滴度：6.13 lgCCID50／mL）由本所生物安全三级实验室选育并保存，均为灭活疫苗候选毒株。
1.2 主要试剂及仪器 0.25%胰酶（批号：2323251）和DMEM高糖培养基（批号：2368006）购自美国Gibco公司；
新生牛血清（批号：18070104）购自杭州四季青生物工程材料有限公司；
核酸提取试剂盒（批号：2021-108）、新型冠状病毒2019-nCoV 核酸检测试剂盒（荧光PCR 法）（批号：2021208）和Stream SP96 型全自动核酸提取仪购自中山大学达安基因股份有限公司；
T25、T75 细胞培养瓶及96 孔细胞培养板购自美国Corning公司；
CellDrop 型细胞计数仪购自美国DeNovix 公司；
QuantStudio 5 型实时荧光定量PCR 仪购自美国ThermoFisher公司。
1.3 病毒培养及观察 将Vero 细胞传代至T75 细胞瓶中，次日当细胞汇合度大于80%时，分别按MOI=0.01、0.001、0.000 1、0.000 01 接种Omicron 4 种亚型毒株BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.5，设3 组平行，用含2.5%新生牛血清的DMEM 培养液于37 ℃，5%CO2培养箱中培养。每隔24 h 显微镜下观察细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）。
1.4 病毒核酸拷贝数检测 每24 h 取病毒培养上清液0.2 mL，依次加入0.5 mL 裂解液和0.02 mL 蛋白酶K，充分混匀后，70 ℃加热15 min。将样本液加入核酸提取仪自动提取核酸，使用新型冠状病毒2019-nCoV 核酸检测试剂盒（荧光PCR 法），于实时荧光定量PCR 仪上检测SARS-CoV-2N和ORF基因的RNA水平。
1.5 病毒滴度测定 采用微量细胞病变法。提前1天将Vero 细胞按（2.0 ～3.0）×105个／mL 的密度接种至96 孔细胞培养板，0.1 mL／孔。每隔24 h 取病毒培养上清液，用病毒培养液10倍系列稀释，共8个稀释度，加入96 孔Vero 细胞培养板，每个稀释度8孔，0.1 mL／孔，每个样品重复滴定3次，置37 ℃，5%CO2培养箱培养4 d，显微镜下观察CPE，病变孔标记为+，根据Kaber法公式计算活病毒滴度。
式中L 为最高稀释度的对数；
d 为稀释对数之间的差；
s为阳性管比率总和。
1.6 统计学分析 应用GraphPad Prism 8软件进行统计学分析，组间比较采用t检验，多重比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 不同MOI 对CPE 的影响 4 种毒株按不同MOI接种后24 h，Vero 细胞均未出现CPE；
接种后48 h，BA.1、BA.1.1、BA.2 毒株按MOI = 0.01 和0.001 接种的Vero 细胞均出现25%CPE，按MOI=0.000 1 和0.000 01 接种的Vero 细胞均未出现CPE，BA.5 毒株按MOI = 0.01、0.001、0.000 1 和0.000 01 接种的Vero 细胞病变程度分别为50%、50%、25%和0；
接种后72 h，4种毒株按不同MOI接种的Vero细胞均出现CPE，且随接种量的增加而加剧，接种量相同时病变程度为BA.5 ＞BA.1／BA.2 ＞BA.1.1，见图1；
接种后96 h，仅BA.1.1 毒株按MOI = 0.000 01 接种的Vero 细胞出现50% CPE，其余毒株按不同MOI 接种的Vero细胞CPE均大于75%。见表1。
表1 不同毒株接种Vero细胞不同时间的CPETab.1 CPE of Vero cells inoculated with different variants for different time durations
图1 不同毒株按不同MOI 接种Vero 细胞培养72 h 的CPE（×100）Fig.1 CPE of Vero cells inoculated with different variants at different MOI for 72 h（×100）
2.2 不同MOI 对病毒核酸拷贝数的影响 BA.1、BA.1.1、BA.5 毒株按MOI=0.01、0.001、0.000 1 和0.000 01 接种，N和ORF基因拷贝数均在0 ～72 h 呈增长趋势，72 h达峰值，72 ～96 h趋于稳定。BA.2毒株按MOI=0.000 1 和0.000 01 接种，N和ORF基因拷贝数均在0 ～72 h 持续增长，72 h 达峰值；
而按MOI=0.01 和0.001 接种，48 h 达峰值，但48 与72 h比较，N和ORF基因拷贝数差异均无统计学意义（N基因：t分别为2.668 和2.215，P分别为0.055 9 和0.157 2；
ORF基因：t分别为2.049和0.483 9，P分别为0.109 8和0.653 7）。见图2和图3。
图2 不同毒株接种Vero细胞不同时间的N基因拷贝数Fig.2 N gene copy number in Vero cells inoculated with different variants for different time durations
图3 不同毒株接种Vero 细胞不同时间的ORF 基因拷贝数Fig.3 ORF gene copy number in Vero cells inoculated with different variants for different time durations
2.3 不同MOI对病毒滴度的影响 BA.1.1、BA.2和BA.5毒株按MOI=0.01、0.001、0.000 1和0.000 01接种，病毒滴度在0 ～72 h 呈增长趋势，72 h 达峰值，72 ～96 h 降低。BA.1 毒株按MOI = 0.001、0.000 1和0.000 01接种，病毒滴度在0 ～72 h持续增长，72 h达峰值；
而按MOI=0.01接种，48 h达峰值，48与72 h比较，差异有统计学意义（t= 3.479，P= 0.025 4）。多重比较单因素方差分析显示，BA.1 毒株按MOI=0.01接种48 h的病毒滴度显著低于按MOI=0.001 ～0.000 01接种72 h（q=4.543，P=0.004 9）；
BA.1.1毒株按MOI = 0.01 接种72 h 的病毒滴度显著低于按MOI=0.001 ～0.000 01 接种72 h（q=3.704，P=0.015 2）；
BA.2及BA.5毒株按MOI=0.01 ～0.000 01接种72 h 的病毒滴度差异均无统计学意义（BA.2：q分别为2.095、0.159 9 和0.191 9，P分别为0.159 5、0.996 9 和0.994 7；
BA.5：q分别为2.219、1.941 和1.387，P分别为0.133 1、0.198 8和0.418 5）。见图4。
图4 不同毒株接种Vero细胞不同时间的病毒滴度Fig.4 Virus titer of Vero cells inoculated with different variants for different time durations
续图4 不同毒株接种Vero细胞不同时间的病毒滴度Fig.4（Continued）Virus titer of Vero cells inoculated with different variants for different time durations
有研究表明，在常用分离培养病毒的细胞系中，猴肾细胞系对SARS-CoV-2 最为敏感，包括来自非洲绿猴肾的Vero细胞系［13-16］。本研究对SARS-CoV-2 4种Omicron 变异株在Vero 细胞中的培养条件进行优化，以期为其全灭活疫苗生产工艺提供参考。病毒扩增的主要目标是产生尽可能多的活病毒，同时将细胞保持在最佳病毒生产力状态，可通过优化收获时间和MOI来实现［17-18］。
病毒扩增能力在细胞水平体外检测指标主要包括CPE、病毒核酸拷贝数及病毒滴度。本研究通个这3 个指标监测不同MOI 和收获时间对病毒培养的影响。病毒滴度可直接反映活病毒量，为主要分析指标；
病毒核酸拷贝数可表明病毒核酸含量，包含所有死病毒和活病毒量，在限定感染时间内与病毒量存在一定的数量关系［19］，以及核酸受培养环境及代谢产物等影响导致其不稳定性［20-21］，因此仅可作为参考指标；
CPE 直接表明病毒对细胞的融合原性［22-25］，目前报告未显示其与病毒量有直接或间接相关性，与病毒自身感染特性相关。
本实验CPE 结果显示，在病毒接种72 ～96 h，Vero 细胞CPE 均达75%～100%，此时Vero 细胞已无法再为病毒增殖提供基质；
N基因核酸拷贝数检测结果显示，4 种毒株按不同MOI 接种，72 h 时，N 和ORF基因拷贝数均达峰值，表明72 h 后病毒不再增殖；
病毒滴度检测结果显示，4种毒株在72 h时（BA.1 MOI = 0.01 时为48 h），病毒滴度最高。因此，4 种Omicron 变异株在Vero 细胞中培养最佳收获时间为72 h。进一步收获时间为72 h 时的最佳接种量进行分析，结果显示，BA.1、BA.1.1、BA.2及BA.5的最适MOI分别为0.001 ～0.000 01、0.001 ～0.000 01、0.01 ～0.000 01及0.01 ～0.000 01。
综上所述，本研究优化了SARS-CoV-2 4 种Omicron 变异株BA.1、BA.1.1、BA.2 及BA.5 疫苗候选株在Vero 细胞中的培养条件，为采用Vero 细胞为基质的SARS-CoV-2 Omicron变异株疫苗的大规模生产提供了参考。
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