许 航,孟 林
(1. 广西中医药大学,广西 南宁 530222;2. 广西骨伤医院,广西 南宁 530012)
骨关节炎是一种导致关节疼痛、畸形和活动受限的慢性关节疾病,常见于中老年人,其发病机制目前尚不十分清楚［1］。在2017年,我国每年约有6 120万骨关节炎患者,年龄标化患病率为3.1%,65岁以上人群骨关节炎总体患病率高达8.1%,每10万人因骨关节炎导致的伤残调整生命年从1990年的92.5年增加到2017年的98.8年,给个人、家庭和社会带来巨大的负担［2］。目前,临床上有多种方法治疗骨关节炎,早期以西药治疗为主,如塞来昔布、双氯芬酸钠、硫酸氨基葡萄糖等。然而,这些西药大多数具有一定的不良反应,如双氯芬酸钠可引起头晕、腹痛、呕吐、皮疹等不良反应。中晚期当关节出现增生及畸形明显时,关节活动明显受限,此时的办法唯有考虑花费高且风险较大的关节置换手术。因此,开发安全有效、价格低廉的治疗骨关节炎的新药刻不容缓。
祖国医学在治疗骨关节炎方面的历史超过两千年,根据其临床症状、体征及古籍记载,多以“骨痹”“痹症”“膝痹”等命名,其认为“骨痹”的发生多为肝肾亏虚、瘀血阻滞、痰瘀互结等因素所致。近年来,具有补气养血、行滞通痹的黄芪逐渐引起各大学者的关注。黄芪首见于《神农本草经》,其味甘、微温、无毒,是豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的主根,后世称其为补药之长。现代药理学研究显示,黄芪具有增强免疫、改善微循环、抗肿瘤等功效［3］。而随着近年来研究人员对黄芪的不断深入研究发现,黄芪在促进软骨生长、愈合的同时,还能提高软骨细胞抗损伤能力。罗继红等［4］实验证明,黄芪水煎液可有效抑制大鼠关节软骨细胞的凋亡。廖鸿等［5］证明,黄芪注射液可有效减缓兔关节软骨的过氧化损伤。陈泽林等［6］也发现,黄芪注射液可改善患者关节炎症反应。而骨关节炎的发生,实质就是在炎症的主导下,软骨降解和软骨合成过程中的动态平衡被打破,导致关节腔内生理代谢发生变化,最终使关节形态和力学特征发生改变的过程［1］。目前临床治疗上,黄芪多数是以复方形式存在,其复方在治疗骨关节炎的疗效及机制已被现代医学证实和阐释［7-8］,但极少以单味中药或活性成分形式治疗骨关节炎。在此,对近些年来黄芪活性成分在治疗骨关节炎的相关机制、现在面临的问题及未来发展方向等进行综述,为其临床应用乃至新药的开发提供思路和参考。
黄芪作为经典的补气中药,最近药理研究显示,目前从黄芪中可分离出超过70种有效成分,包含三萜皂苷类:皂苷Ⅰ-Ⅶ、异黄芪苷Ⅰ-Ⅲ、大豆苷Ⅰ、环黄芪醇等,多糖类:主要为葡萄糖和杂多糖,黄酮类:芒柄花素、毛蕊异黄酮、山柰酚等［9］。查阅文献得知,黄芪这三类活性物质具有抗炎与修复软骨的功能,对治疗骨关节炎起重要作用。
1.1黄芪皂苷 黄芪皂苷是从黄芪药材中提取出来的各三萜皂苷类成分的总称,具有多种药理活性,包括调节免疫、抗衰老、抗炎、清除氧自由基等功能［10］。研究发现,这些成分对体外培养的软骨细胞均具有保护和促进作用,在骨关节炎治疗方面发挥重要作用［11-12］。考虑到黄芪皂苷成分复杂,所含活性成分较多,单以黄芪皂苷为整体进行研究无法证实具体何种成分发挥作用,因此,在黄芪皂苷的研究中,对于其所含成分的药理研究极其重要。
黄芪甲苷(皂苷Ⅳ)是皂苷类里面最主要的活性成分,同时也是黄芪中最重要的活性成分,其占总皂苷的80%以上,现代研究学者对于皂苷类成分的研究也主要集中于黄芪甲苷,而以黄芪皂苷为整体研究其对软骨促进作用机制的文献报道较少［13］。黄芪甲苷具有广泛的药理学活性［14-15］,特别是近年来发现其对软骨细胞具有增殖和保护作用,成为关节疾病研究领域的一个热点。相关研究发现,黄芪甲苷对软骨细胞增殖及活性的影响与其浓度密切相关。刘建红等［16］用不同浓度的黄芪甲苷来处理人退变软骨细胞,发现其对软骨细胞增殖呈浓度依赖性,并在100 mmol/L时促增殖作用较强。汤晓晨等［17］研究发现,25,50,75,100 mmol/L黄芪甲苷能促进软骨细胞增殖,而在500 mmol/L黄芪甲苷作用下其结果则与之相反。张猛［18］通过实验证实了黄芪甲苷可以促进软骨细胞在体外三维培养条件下增殖、合成细胞外基质。赵永见等［19］发现黄芪甲苷能够减轻切除小鼠前交叉韧带所致骨关节炎的病理改变,提示黄芪甲苷具有较强的抗骨关节炎活性。
黄芪甲苷治疗骨关节炎的机制主要是通过抑制炎症反应及促进软骨细胞的增殖调控软骨代谢［20］。Li等［21］在实验中发现黄芪甲苷促进软骨细胞增殖是通过阻断胞内核因子κB(nuclearfactor κB,NF-κB)激活,进而抑制炎症因子释放来实现的。王德刚等［22］研究发现,黄芪甲苷可通过阻断Wnt配体/β连环蛋白(Wnt/β-catenin)信号通路,抑制炎症和促进软骨细胞功能修复。余素娇等［23］研究发现黄芪甲苷能抑制NOD样受体蛋白3(nod-like-receptor protein 3,NLRP3)炎性小体的激活,阻断半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)途径参与的软骨细胞损伤。Luo等［24］研究发现,黄芪甲苷可以上调了SW1353细胞中Yes相关蛋白1(Yes-associated protein,YAP1)、γ-肌动蛋白基因(Actin G1,ACTG1)、玻连蛋白(vitronectin,VNT)、1型胶原蛋白(collagen 1,COL1A1)表达,并由此推测黄芪甲苷促软骨细胞增殖作用可能与Hippo信号通路和细胞外基质(extracellular matrix,ECM)受体相互作用信号通路有关。孟祥奇等［25］实验发现黄芪甲苷可明显促进软骨细胞增殖,提高2型胶原蛋白、蛋白多糖蛋白基因mRNA的表达量。刘建红等［16］通过对照实验发现,黄芪甲苷可以通过下调基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)的表达,提高人退变软骨细胞的存活率,延缓骨关节炎软骨的退变。此外,最近还发现激活自噬也是软骨细胞重要保护机制。例如,Liu等［26］研究发现,黄芪甲苷可通过下调自噬标志蛋白p62的表达、增加微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(microtubule-associated protein 1 light chain3Ⅱ,LC3Ⅱ)和LC3Ⅰ的比例,进而提高细胞自噬水平,抑制软骨细胞凋亡,延缓骨关节炎的发生。
黄芪甲苷作为黄芪皂苷乃至黄芪中最重要的活性成分,对黄芪行使行滞通痹作用具有重要意义。其治疗骨关节炎方面的研究最广,文献总数在黄芪各成分之中遥遥领先。除了黄芪甲苷,其他三萜皂苷类成分也同样具有治疗骨关节炎的潜力,Szychlinska等［27］将环黄芪醇与人脂肪间充质干细胞共同培养,发现环黄芪醇可以促进人脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化,并能维持软骨细胞的表型而在软骨组织工程中具有光明的前景。因此,对黄芪皂苷全面深入探索,有助于充分发挥其应用价值。
1.2黄芪多糖 黄芪多糖是黄芪中的多糖类物质的总称,具有显著的抗氧化、抗衰老、增强免疫等作用［28］;其中,其显著的抗氧化作用是黄芪多糖药用功效的重要贡献来源［29］。而相关研究表明,骨关节炎患者关节软骨的氧化应激水平要明显高于正常人［30］,故学者们开始将黄芪多糖防治骨关节炎的重心放在黄芪多糖减轻软骨细胞氧化损伤的机制研究上。肖剑伟等［31］研究发现,黄芪多糖可降低软骨细胞内活性氧所致的氧化应激,从而降低促凋亡因子表达水平,进而恢复软骨细胞相关活性。胡爱心等［32］用黄芪多糖对骨关节炎大鼠进行关节注射,6周后取标本发现,与对照组相比超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性升高,丙二醛(m-alondialdehyde,MDA)水平明显下降,组织学检测也表明黄芪多糖关节注射后明显减轻了关节的炎症反应,提示黄芪多糖可通过抗氧化促进退变软骨的修复。除了抗氧化应激作用,黄芪多糖还可通过其他途径起到防治骨关节炎作用。其中,杨国志等［33］研究发现,从大鼠上分离的软骨细胞在经过黄芪多糖干预后,其产生葡糖氨基聚糖的量明显增加,推测结果与黄芪多糖促进葡萄糖醛酸转移酶Ⅰ的表达有关;史桂荣等［34］研究发现,黄芪多糖可通过抑制金属蛋白酶生成同时促进胶原蛋白合成来保护软骨,并在体外实验中发现黄芪多糖促进了WWP2介导的Notch受体1的泛素化水平,表明这种作用机制可能与抑制Notch 信号通路有关。另有研究发现,黄芪多糖通过提高自噬水平,增强软骨细胞活性［35］。由此可见,黄芪多糖在治疗骨关节炎方面具有潜在的临床应用前景。
1.3黄芪总黄酮 黄芪总黄酮是黄芪中所含有的一类活性成分,有抑制炎症反应、减轻氧化损伤、抗凋亡等作用［36］,因此近些年来许多学者逐渐开始研究其在骨关节炎领域的防治作用。有研究表明,黄芪总黄酮可通过减少炎症因子形成发挥保护关节软骨的作用［37］。研究人员进一步探索发现,黄芪总黄酮通过抑制NF-κB信号通路降低关节炎症反应,保护关节软骨［38］。由于黄芪总黄酮成分复杂,具体哪种成分起作用无法得到证实。因此,人们对黄芪黄酮类成分治疗骨关节炎的研究由总黄酮逐渐转向其所包含的成分。Huh等［39］将芒柄花黄素与正常人和骨关节炎患者软骨下成骨细胞一起培养后,发现明显降低骨关节炎患者软骨下成骨细胞白细胞介素(interleukin,IL)-6、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、骨形态发生蛋白2(bone morphogenic protein2,BMP2)、骨钙素(osteocalcin,OCN)、COL1A1的mRNA表达水平,而正常人软骨下成骨细胞VEGF、BMP-2、OCN、COL1A1的mRNA表达水平则升高,结果表明芒柄花素可降低关节炎症反应和调整软骨下骨重塑,但具体机制有待进一步研究。Choi等［40］通过建立骨关节炎动物模型,研究毛蕊异黄酮葡萄糖苷关节腔注射后治疗骨关节炎的效果,结果表明毛蕊异黄酮葡萄糖苷能减少滑液中的炎症介质分泌并降低了软骨降解。袁小亮等［41］研究发现,槲皮素可降低MMP13的表达并提高TIMP-1的活性,从而抑制软骨细胞外基质降解,对软骨起保护作用。另有研究发现,异鼠李素和山柰酚都可以通过抑制NF-κB信号通路发挥减轻关节炎症的作用［42-43］。廖军锋等［44］发现毛蕊异黄酮通过降低促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的比例,使软骨细胞周期的G0/G1期缩短,从而促进了软骨细胞增殖。由此可见,黄芪总黄酮在防治骨关节炎方面具有很高的研究价值。
目前,尽管黄芪总黄酮对软骨细胞以及动物模型的作用得到深入探讨,但在相关细胞信号通路方面的研究仍较欠缺,在此方面有很大的突破空间。
2.1Wnt/β-catenin信号通路 Wnt/β-catenin是经典Wnt信号通路,由配体蛋白、受体蛋白、胞质蛋白、转录因子及下游靶基因构成,在细胞形态和分化、运动和迁移、增殖和凋亡等方面发挥重要的作用,参与了软骨细胞分化成熟,产生各种酶调控骨关节炎发病的经典途径［22,45］。
Wnt配体会与Frizzled蛋白/LRP5蛋白(Frizzled/LRP)受体结合形成三聚体(Wnt-Fz-LRP),从而激活胞内Dishvelled(DvL)蛋白并抑制糖原合成激酶3β(Glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)活性,进而阻碍β-catenin蛋白、轴蛋白(Axin)、GSK-3β三者组成复合体,抑制了β-catenin磷酸化,使胞质积聚大量β-catenin并向核内转移,与T细胞因子(T cell factor,TCF)/淋巴增强因子(lympho- id enhancer factor,LEF)结合形成复合体,触发下游的SA-β-gal、p53、p16等靶基因的转录,进而导致细胞的异常凋亡及组织降解,导致骨关节炎形成［46］。在黄芪活性成分调控Wnt/β-catenin信号通路影响骨关节炎发生发展中,又以黄芪皂苷的作用最为明显［47］。颜春鲁等［48］研究表明,富硒黄芪皂苷可以提升IL-1β诱导的软骨细胞中Wnt通路内源性拮抗基因DKK-1的表达,从而阻止LRP蛋白、Wnt蛋白和Frizzled受体三者相互作用形成复合体,最终抑制Wnt/β-catenin信号通路,使软骨细胞的增殖活性得到改善。王德刚等［22］将β-catenin基因导入人滑膜细胞后,培养液中MMP-7、软骨寡聚基质蛋白(Cartilage Oligomeric Matrix Protein,COMP)及Ⅱ型胶原羧基端肽(Cterminal propeptide of collagen typeⅡ,CTX-Ⅱ)表达明显高于对照组,而通过黄芪甲苷干预后,则明显抑制了上述炎症介质的表达,提示黄芪甲苷能通过抑制Wnt/β-catenin通路来改善关节炎症。由此可见,Wnt/β-catenin信号通路在黄芪活性成分治疗骨关节炎的过程中,发挥着重要作用。见图1。
图1 黄芪申苷治疗骨关节炎机制
2.2NF-κB信号通路 NF-κB通路是一条在骨关节炎发生发展中起重要作用的信号通路［49］,一般情况下,p50或p65与IκBα组成复合体存在胞质内,当细胞受外界相关信号如脂多糖、IL-1、核因子κB受体激动剂(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)刺激时,IκBα发生磷酸化并降解,p50或p65从胞质进入胞核内,最终促成各种炎症因子的表达,使得如软骨细胞等骨细胞发生凋亡。
相关研究证实,黄芪活性成分可通过调控NF-κB信号通路来抑制炎症反应和软骨降解。Li等［21］研究发现,黄芪甲苷可以通过抑制IL-1β诱导的软骨细胞中IκBα磷酸化,从而使p65滞留在细胞质中不能入核,无法发挥促转录功能,进而抑制炎症因子和软骨降解酶的释放,最终使软骨细胞免受IL-1β损伤。Li等［42］研究发现,异鼠李素可以通过抑制NF-κB和p65的表达,减少NO和PGE2生成,发挥保护软骨作用。任伟亮等［50］研究发现,黄芪总黄酮可通过下调p65蛋白表达,从而阻断NF-κB信号通路,进而减少关节炎性因子释放,并提高SOD、谷胱甘肽过氧化物酶两种抗氧化酶的活性,抑制软骨细胞凋亡。张冲［38］研究发现,黄芪总黄酮可以上调骨保护素(osteoprotegerin,OPG)表达,OPG结合并中和RANKL,使NF-κB活化受到抑制,从而改善受试动物关节炎症反应。Zhuang等［43］研究发现,山柰酚可以抑制IκBα降解,使p65无法入核,中断NF-κB转录过程,发挥抗炎作用。由此可见,黄芪活性成分可通过调控NF-κB信号通路,延缓骨关节炎进展。见图2。
图2 黄芪活性成分对NF-κB信号通路的调控作用。
2.3PI3K/AKT/mTOR信号通路 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是一类丝氨酸/苏氨酸激酶。在营养充足的情况下,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体1(mammalian target of rapamycincomplex1,mTORC1)可将各种信号刺激来促进合成代谢,并阻断分解代谢,从而调控细胞生长增殖。mTOR主要有3个上游分支:磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶(p-rotein kinase B,AKT)、单磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMP-activated p-rotein kinase,AMPK)和大鼠肉瘤(rat sarcoma viral oncogene homolog,Ras)/快速加速纤维肉瘤(rapidly accelerated fibrosarcoma,Raf)/促分裂原-细胞外信号激酶(mitogen extracellular-signal kinase,MEK)/细胞外信号调节激酶(extracellular-signalregulated protein kinase,ERK),其中与骨关节炎联系密切的主要为PI3K/AKT/mTOR信号通路［51］。研究表明,一些中药活性成分可以通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路,达到控制炎症和抑制软骨细胞凋亡的作用,最终延缓关节软骨的降解［52-53］。因此,PI3K/AKT/mTOR是中药治疗骨关节炎的一条潜在信号通路。
而目前相关研究已证实,黄芪活性成分可通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路来保护关节软骨。颜春鲁等［12］通过实验证实,富硒黄芪皂苷可通过抑制调控PI3K/AKT/mTOR信号通路,恢复自噬相关基因表达水平,抑制IL-1β诱导的软骨细胞凋亡,从而对关节软骨起保护作用。Meng等［35］研究发现,黄芪多糖可以通过PI3K/AKT/mTOR信号通路调控自噬,从而抑制滑膜增生和滑膜炎症反应,进而避免了软骨破坏。Jiang等［54］研究发现,山柰酚可以通过抑制核心蛋白聚糖(decorin,DCN)的表达,上调软骨组织中的miR-146a,激活miR-146a/PI3K/AKT/mTOR轴,发挥抑制关节炎症作用。
由此可见,黄芪活性成分可通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路,来保护软骨细胞以及调控其生长增殖,并同时能够抑制炎症反应,最终起到防治骨关节炎的作用。见图3。
图3 黄芪活性成分对PI3K/AKT/mTOR信号通路的调控作用
2.4MAPK信号通路 丝裂原活化蛋白激酶(mito-gen-activated protein kinase,MAPK)是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是细胞外信号至细胞内反应的重要传递系统,它在细胞生长和分化、增殖和凋亡及突变发生等方面起重要的作用。MAPK通路主要由细胞外信号调节蛋白激酶(Extracellular signal-activated kinase,ERK)、c-jun氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinase,JNK)和p38蛋白激酶组成。ERK是细胞受到应激后决定细胞生死的重要因素,其可以促进增殖分化或导致凋亡。JNK在细胞应激中亦起到重要作用,同时可以被多种细胞信号激活。因此也被称为应激活化激酶。P38蛋白激酶是一种38kD酪氨酸磷酸化蛋白激酶,可被各种生理和病理刺激激活,触发细胞凋亡。此外,MAPK还可以激活细胞内下游通路如NF-κB和AP-1等信号通路,进而启动一系列磷酸化或聚合酶链反应。大量研究表明,MAPK信号通路对骨关节炎的发生发展起重要作用［55］。
目前相关研究已证实,黄芪活性成分可通过调控MAPK信号通路来保护关节软骨。王象鹏等［56］研究发现,槲皮素可通过抑制细胞p38MAPK、p-p38MAPK的表达来减少MMP13、解聚蛋白样金属蛋白酶-4(A disintegrin-like and metalloproteinase with thrombospondin type-1 motifs-4,ADAMTS-4)的释放起到保护关节软骨的作用。Huang等［57］研究表明,山柰酚具有显著抑制关节炎症的能力,主要是通过抑制MAPK信号通路中p38通路和ERK通路,进而下调炎性因子表达来抑制关节炎症的。
上述提到,MAPK信号通路的下游存在多条重要的通路。Xu等［58］发现黄芪甲苷可通过靶向p38MAPK/NF-κB和JNK/NF-κB信号通路抑制NF-κB p65蛋白的表达,从而抑制炎症因子的形成并保护关节软骨。见图4。
图4 黄芪甲苷对NF-κB p65蛋白的抑制作用
目前对于黄芪各成分治疗骨关节炎的相关研究现状不一,相关研究信息较为复杂,为了使读者一目了然,加以表格进行汇总,见表1。
表1 黄芪中各成分类别、组成、相关信号通路及参考文献的总结
近年来,伴随着人们生活节奏的加快,暴饮暴食、肥胖、创伤、人口老龄化等问题不断显现,使骨关节炎的发生率逐年上升,加之诊疗上的不规范,晚期致残率极高［59］,逐渐引起了人们的重视。由于骨关节炎等慢性关节疾病手术治疗具有一定的风险性,且手术的远期治疗效果也不尽如人意［60］。而非手术治疗,目前临床上主要以口服非甾类消炎药和氨糖类药物为主,但疗效一般,尤其是长期口服非甾类消炎药所产生的消化道反应、凝血障碍等问题,是目前制约其临床应用的一大因素。因此,充分开发治疗骨关节炎的中药材就显得极其重要。中医学根据骨关节炎“肝肾亏虚,痰瘀互结”的病因病机,运用补气行滞中药发挥补肝肾、行滞通痹之功,解决软骨修复障碍,改善软骨细胞外基质环境,促进软骨细胞生成［61］。临床通过中药治疗骨关节炎具有较高的有效性和安全性［62］,因此,以黄芪为代表的补气行滞消肿类中药在治疗骨关节炎方面具有很高的应用价值。
尽管国内外对黄芪活性成分调控骨关节炎相关信号通路机制的研究取得一定的成果,但还存在许多方面的不足。首先,目前对于黄芪活性成分的研究还主要集中在三萜皂苷、多糖、黄酮这三大类物质,其中以黄芪甲苷为主,而黄芪所含的多酚及微量元素等则鲜有报道,这一块需要各学者更加深入的研究探索。其次,黄芪活性成分治疗骨关节炎的研究现多局限于某个途径和靶点在某种细胞上的作用,其许多关键作用机制尚未完全了解。除了文中所提到的相关信号通路外,还存在其他的相关信号通路。不同的信号通路在体内构成了一个复杂的网络,单就某条信号通路进行实验探究,容易缺乏严谨性。此外,骨关节炎发生、发展机制复杂,且受限于目前科研技术水平和多条信号通路之间一起研究的繁杂性,一些分子机制仍不能明确,未能取得最佳的治疗效果。因此,探索多信号通路之间的相互作用和调控干预疾病相关信号通路药物是一项很有前途的工作。随着对黄芪活性成分研究的不断深入,相信其在骨关节炎等疑难病症的治疗中将会有广泛的应用前景。
利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。
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