全迎新, 邓代武, 金彪, 金东日
( 1.延边大学 理学院, 吉林 延吉 133002; 2.延边大学 分析测试中心, 吉林 延吉 133002 )
氨基酸是人体蛋白质的主要组成部分,具有促进大脑发育、防止细胞退化等生理功能[1].研究显示,人体缺乏氨基酸会引发多种疾病[2].复方氨基酸胶囊(8-11)含有8种人体必需氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸和甲硫氨酸)和11种维生素,对促进营养组织细胞生长和由氨基酸缺乏导致的蛋白质合成障碍等具有良好的改善效果[3].目前,测定氨基酸的方法主要有高效液相色谱法(HPLC)[4]、薄层色谱法(TLC)[5]、毛细管电泳法(CE)[6]等,其中HPLC因具有灵敏度高和适用范围广等优点而被广泛应用[7].但由于氨基酸具有极性高、挥发性低以及大部分氨基酸不具有生色基团的特性,因此对其分离和检测存在一定困难[8].目前,一般采用衍生化试剂对氨基酸进行衍生化来提高其检测灵敏度,通常使用的衍生化试剂主要有异硫氰酸苯酯[9-10]、邻苯二甲醛[11-12]、2,4-二硝基氟苯[13-14]等.其中2,4-二硝基氟苯也称为桑格(Sanger)试剂,目前已被用于鉴定多肽或蛋白质的N-末端氨基酸[15-16].2020年,邓红英等[8]采用桑格试剂测定了复方氨基酸注射液中的氨基酸含量,但由于该衍生化试剂存在副产物干扰较强等问题而限制了其在氨基酸分析中的应用.为此,本文采用类桑格试剂1-(5-氟-2,4-二硝基-苯基)-4-甲基哌嗪(PPZ)作为衍生化试剂,并以此建立了一种测定氨基酸含量的柱前衍生化的高效液相色谱法.
1.1 仪器
SPD-16高效液相色谱仪,岛津公司;AV-300超导核磁共振仪,布鲁克公司;高效液相色谱-质谱联用仪,安捷伦科技有限公司;N-100旋转蒸发仪,上海爱朗仪器制造有限公司;XW-80旋涡混合器,上海驰唐电子有限公司;HB-100恒温金属浴,杭州大和热磁电子有限公司;TGL-15B离心机,上海安亭科学仪器厂;0.46 μm有机相微孔滤膜,上海安谱科学仪器有限公司;pH值测试仪、电子天平,上海奥豪斯仪器有限公司.
1.2 材料
乙腈(分析纯),上海安谱科技实验科技股份有限公司;碳酸氢铵(分析纯),上海斯信生物科技有限公司;甲醇(色谱级)、甲酸(色谱级),北京伊诺凯试剂有限公司;缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸:均为分析纯,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;亮氨酸(分析纯),上海皓鸿生物医药科技有限公司;色氨酸(分析纯),上海吉尔生化有限公司;二氯甲烷(分析纯),大茂化学试剂科技有限公司;N-甲基哌嗪(分析纯),上海TCI化学试剂有限公司;1,5-二氟-2,4-二硝基苯(分析纯),东京化成工业株式会社;硅胶(37～48 μm),青岛海洋化工厂分厂;聚丙烯离心管,上海科进生物技术有限公司;复方氨基酸胶囊(8-11),深圳万和制药有限公司;移液枪,德国普兰德有限公司.
1.3 衍生化试剂PPZ的合成及表征
本文按照文献[17]的方法合成衍生化试剂PPZ.在含有1 mL乙腈的圆底烧瓶中加入1,5-二氟-2,4-二硝基苯(100 mg,0.5 mmol),然后在搅拌下逐滴加入28 μL(0.3 mmol)的N-甲基哌嗪;室温下搅拌30 min,柱层析洗脱浓缩物(洗脱液为二氯甲烷和甲醇混合液(体积比为20∶1))后去溶剂得黄色固体60.5 mg,产率为71%.ESI-MS:m/z285[M+H]+.1H NMR(300 MHz,CDCl3),2.37(s,3H),2.59(t,J=6.0 Hz,4H),3.29(t,J=6.0 Hz,4H),6.79(d,J=9.0 Hz,1H),8.71(d,J=9.0 Hz,1H).13C NMR(75 MHz,CD3OD),158.3(d,J=159.8 Hz),150.2(d,J=7.5 Hz),134.4,127.4(d,J=5.3 Hz),126.5,107.7(d,J=15.8 Hz),53.8,49.7,44.5.
1.4 溶液的配制
衍生化试剂:称取28.4 mg的PPZ置于10 mL的容量瓶中,加入乙腈和水的混合溶液(体积比为22∶78)将其溶解并定容至10 mL,由此得到10 mmol/L的PPZ标准溶液.
标准对照溶液:首先分别称取13.1 mg亮氨酸(Leu)、13.1 mg异亮氨酸(Ile)、20.4 mg色氨酸(Trp)、11.7 mg缬氨酸(Val)、14.9 mg甲硫氨酸(Met)、16.5 mg苯丙氨酸(Phe)、11.9 mg苏氨酸(Thr)、14.6 mg赖氨酸(Lys)置于10 mL的容量瓶中,然后分别用乙腈和水的混合溶液(体积比为22∶78)将其稀释至10 mL,由此得到8种10 mmol/L的标准氨基酸溶液.
分别取上述Lys、Thr、Trp、Phe、Val、Met、Leu、Ile标准溶液10 μL置于聚丙烯管,然后再加入20 μL乙腈和水的混合溶液(体积比为22∶78),由此得到1 mmol/L的8种混合标准氨基酸溶液.
供试品溶液:取复方氨基酸胶囊(8-11)1粒(0.35 g/粒),将内容物倾出后研磨成细粉;称取0.175 g细粉置于100 mL容量瓶内,加入适量乙腈和水的混合溶液(体积比为22∶78)后超声20 min使其溶解,并定容至刻度;离心15 min(8000 r/min),上清液用0.46 μm的微孔滤膜过滤,所得溶液即为供试品溶液.
缓冲溶液:称取碳酸氢铵1 mmol置于100 mL容量瓶内,用超纯水将其定容至100 mL后即得pH为8.49的碳酸氢铵缓冲溶液.
上述所有溶液均在4 ℃下密封保存.
1.5 通用衍生化反应
分别取1 mmol/L的氨基酸(10 μL)、碳酸氢铵缓冲溶液(25 μL)和10 mmol/L的衍生化试剂PPZ(10 μL)置于1.5 mL的聚丙烯管中,用旋涡混合器振荡1 min后将试管放入恒温(40 ℃)金属浴装置内反应3 h.
1.6 色谱条件
色谱柱为Mightysil RP-18 GP(3 μm,150 mm×4.6 mm);流动相为甲醇和水的混合液(甲醇和水的体积比为1∶1,且混合液中含体积分数为0.2%的甲酸);流速为0.3 mL/min;柱温为25 ℃;UV检测波长为354 nm;进样体积为2 μL.
2.1 衍生化反应的条件
图1为PPZ与氨基酸的反应式.在碱性条件下,氨基酸α-氨基的N端攻击PPZ的含氟碳,由此生成稳定的氨基酸衍生物.本文以Trp、Thr和Met来探究反应温度、反应时间和反应摩尔比对该衍生化反应的影响.
图1 PPZ与氨基酸的反应式
2.1.1反应时间的确定
在反应温度为40 ℃、氨基酸与衍生化试剂的摩尔比为1∶10的条件下,选取不同的反应时间(分别为0.5、1、1.5、2、2.5、3、4 h)对Trp、Thr和Met的衍生化反应进行考察.由图2可以看出,当反应时间为3 h时衍生化产物的收率最大,因此本文确定最佳反应时间为3 h.
图2 反应时间对衍生化反应的影响
2.1.2反应温度的确定
在反应时间为3 h,氨基酸与衍生化试剂的摩尔比为1∶10的条件下,选取不同的反应温度(分别为25、30、35、40、45 ℃)对Trp、Thr和Met的衍生化反应进行考察.由图3可以看出,在40 ℃下衍生化产物的收率最大,因此本文确定最佳反应温度为40 ℃.
图3 反应温度对衍生化反应的影响
2.1.3反应摩尔比的确定
在反应温度为40 ℃、反应时间为3 h的条件下,选取不同浓度的衍生化试剂(2、5、10、20、30 mmol/L)与Trp、Thr和Met(1 mmol/L)分别进行衍生化反应(氨基酸与衍生化试剂的摩尔比分别为1∶2、1∶5、1∶10、1∶20、1∶30).由图4可以看出,当氨基酸与衍生化试剂的摩尔比为1∶10时衍生化产物的收率最大,因此本文确定最佳反应摩尔比为1∶10.
图4 反应摩尔比对衍生化反应的影响
2.1.4色谱分离条件的确定
根据优化的衍生化反应条件对8种标准混合氨基酸衍生物进行了HPLC分析,结果如图5所示.由图5可以看出,当流动相中的甲醇和水的体积比为1∶1时,8种氨基酸的分离效果最好.
2.1.5线性关系与检出限
根据优化的衍生化反应和色谱分离条件,在0.5～1000μmol/L的浓度范围内对8种氨基酸进行了衍生化反应.以氨基酸的浓度(x)为横坐标,以对应的衍生化产物的色谱峰面积(y)为纵坐标,得到了8种氨基酸的工作曲线、线性方程、相关系数及检出限(LOD),见表1.本文以各组分信噪比满足3∶1为检出限.
1为Lys-PPZ, 2为PPZ, 3为Thr-PPZ, 4为Trp-PPZ, 5为Met-PPZ, 6为Val-PPZ, 7为Phe-PPZ,8为Ile-PPZ, 9为Leu-PPZ图5 8种标准氨基酸衍生物的HPLC图
表1 8种氨基酸的线性范围、线性方程、相关系数和最低检测限
2.2 复方氨基酸胶囊(8-11)的HPLC分析
根据优化的衍生化反应和色谱分离条件对复方氨基酸胶囊(8-11)中的8种氨基酸衍生物进行HPLC分析,结果见图6.由图6可以看出,当流动相中的甲醇和水的体积比为1∶1时,8种氨基酸的分离效果最好.
1为Lys-PPZ, 2为PPZ, 3为Thr-PPZ, 4为Trp-PPZ, 5为Met-PPZ, 6为Val-PPZ, 7为Phe-PPZ,8为Ile-PPZ, 9为Leu-PPZ图6 复方氨基酸胶囊(8-11)衍生物的HPLC图
2.3 方法学研究
2.3.1样品含量的测定及重复性试验
根据优化的衍生化反应和色谱分离条件对复方氨基酸胶囊(8-11)中的8种氨基酸衍生物进行HPLC分析,平行3次,并计算复方氨基酸胶囊样品中各氨基酸的质量,结果见表2.由表2可以看出,测定结果的RSD为0.18%～0.65%,这表明本文方法的重复性良好.
表2 胶囊中8种氨基酸的含量及重复性测定结果
2.3.2加标回收试验
取1.4中配制的供试品溶液6份(每份10 μL)置于聚丙烯管中,并分成2组(每组3份);在各组中分别加入1 mmol/L的标准对照溶液10、50 μL,然后将其定容至100 μL(加标量分别为0.1、0.5 mmol/L).根据优化的衍生化反应和色谱分离条件测定各氨基酸的色谱峰面积,并根据峰面积的变化计算回收率(结果见表3).由表3可知,8种氨基酸的加标平均回收率为90.0%～104.3%,其RSD为0.57%～2.29%.上述结果表明该方法具有良好的准确度.
表3 加标回收率(n=6) %
利用本文建立的PPZ柱前衍生化HPLC法对复方氨基酸胶囊(8-11)中的8种氨基酸含量进行测定显示,该方法具有重现性好、检出限低、准确度高等优点,因此该方法可为检测药物中的氨基酸提供参考.在本文研究中,衍生化试剂存在衍生化时间较长的缺点,因此在今后的研究中我们将探讨如何优化衍生化试剂以提高本文方法的适用性.
猜你喜欢反应时间试剂复方Anti-hypertensive and endothelia protective effects of Fufang Qima capsule (复方芪麻胶囊) on primary hypertension via adiponectin/adenosine monophosphate activated protein kinase pathwayJournal of Traditional Chinese Medicine(2021年6期)2021-08-09国产新型冠状病毒检测试剂注册数据分析现代仪器与医疗(2021年1期)2021-06-09硫脲浓度及反应时间对氢化物发生-原子荧光法测砷影响科学与财富(2021年33期)2021-05-10Protective effects of Fufang Ejiao Jiang against aplastic anemia assessed by network pharmacology and metabolomics strategyDigital Chinese Medicine(2021年4期)2021-02-14用反应时间研究氛围灯颜色亮度对安全驾驶的影响汽车零部件(2018年5期)2018-06-13环境监测实验中有害试剂的使用与处理中国资源综合利用(2017年4期)2018-01-22HPLC-DAD法同时测定复方罗布麻片Ⅰ中4种成分中成药(2017年8期)2017-11-22非配套脂蛋白试剂的使用性能验证现代检验医学杂志(2016年1期)2016-11-12复方南星止痛膏治疗寒湿瘀阻证336例随机对照研究中国药业(2014年12期)2014-06-06厌氧反应时间对反硝化聚磷工艺的影响同济大学学报（自然科学版）(2013年3期)2013-03-04