徐纯依 周东旭 梁浩威 胡琼澳 徐智星 王辉 寿旗扬*
糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病常见微血管并发症之一，也被认为是终末期肾病的主要原因［1］。据统计，我国约30%～40%的糖尿病患者有肾病并发症，且发展为终末期肾病的占比逐年增加［2］。中医临床根据DN 进展各期的不同症状，分为气阴两虚、脾肾阳虚、肾体劳衰三个阶段［3］。临床上采用从脾论治的方法治疗DN。七味白术散（Qiwei Baizhu powder，QWBZP）主要功效是健脾益气、生津止渴，用于糖尿病气阴两虚所致的小便频数、不食而渴、腰膝酸软、形寒畏冷、舌淡苔白、脉细无力者［4］。近年来，网络药理学被广泛应用于药物和中医药活性成分的发现，其通过网络在系统层面分析药物与疾病的分子关联［5］。从网络层面观察中药对疾病的干预与影响，从新的角度认识中药作用机制，为中医药研究和中药新药研发提供新的机遇和模式。
1.1 七味白术散化合物与靶标获取 应用中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）收集人参、茯苓、白术、甘草、木香、藿香、葛根七味药的所有化合物成分。以口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18 为条件筛选得到七味白术散中的有效活性成分，并应用TCMSP 获取筛选后有效活性成分所对应的靶点信息。将所得的靶点信息导入Uniprot 数据库（https：//www.uniprot.org/）转换为对应的基因Symbol，得到靶基因的官方名称。
1.2 “中药-活性成分-靶点”网络图构建 将TCMSP 中获得的七味白术散活性成分和对应靶点导入Cytoscape3.7.1 软件绘制“中药-活性成分-靶点”网络图，对七味白术散的活性成分和作用靶点之间的关系进行可视化分析，并借助插件筛选得到度值排名前十的核心成分。
1.3 DN 疾病基因获取 在GeneCards（https：//www.genecards.org/）、DrugBank（https：//go.drugbank.com/）、OMIM（https：//omim.org/） 数 据 库 中，以“diabetic nephropathy”为关键词检索疾病相关基因。删除检索结果中重复的靶点以获取候选的DN 疾病基因，与七味白术散成分作用靶点取交集基因，并将结果导入韦恩图绘制网站（http：//jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html）进行韦恩图绘制。
1.4 蛋白质网络互作图（PPI）构建及核心靶点筛选 将所得交集基因输入STRING（https：//string-db.org/）数据分析平台进行PPI 分析，数据分析模式设定为“Multiple proteins”，物种设定为“Homo sapiens”。选择设置置信度≥0.9 并隐藏孤立蛋白后生成PPI 网络图，将分析结果导出为tsv 格式文件。为了进一步分析蛋白质之间的关系，将tsv 文件导入Cytoscape3.7.1 软件，借助CytoNCA 插件筛选出PPI 网络中的关键靶点，根据度中心性（DC）、介度中心性（BC）、接近中心性（CC）等参数筛选获得核心靶点。在PPI 网络中，以DC、BC、CC 大于中位数的靶点作为七味白术散作用的核心靶点，并以Degree 值降序排序，筛选得到排序前10 的基因。
1.5 GO 富集以及KEGG 通路富集分析 将核心靶点导入Metascape 数据库（http：//metascape.org/）进行GO 富集分析以及KEGG 通路富集分析，将物种限制为“Homo sapiens”，分析模式选择“Custom analysis”，以P＜0.01 为条件进行筛选。选择排名前10 的条目进行可视化分析。
1.6 分子对接 为验证活性成分与核心靶点之间的结合活性，对“中药-活性成分-靶点”网络中度值排名前10 的活性成分和PPI 网络中度值排名前5 的靶点进行分子对接。从TCMSP 数据库中获取活性成分的PubChem CID 号，并在PubChem 数据库中下载化合物的3D 立体构像文件，应用OpenBabel 软件转换文件格式。从PDB 数据库（https：//www.rcsb.org/）筛选并下载符合条件的蛋白质结构，应用PyMol 软件进行去除水分子和配体、加氢预处理。将处理后的蛋白质和小分子导入AutoDock 软件进行结合能计算，最后将对接结果导入PyMol 软件进行可视化分析。
2.1 七味白术散化学成分及靶标筛选结果 以OB ≥30%和DL ≥0.18 从TCMSP 数据库中筛选得到七味白术散七种中药的活性成分157 种，去除重复成分后共149 种，其中人参22 种，茯苓15 种，白术7种，甘草92 种，木香7 种，藿香10 种，葛根4 种。以“diabetic nephropathy”为关键词从GeneCards、OMIM、DrugBank 数据库中共获得1,934 个疾病靶点，与七味白术散成分作用靶点进行比对后得到150 个交集基因，见图1。将TCMSP 数据库中筛选得到的七味白术散活性成分和对应靶标导入Cytoscape3.7.1 软件构建“中药-活性成分-靶点”网络图，见图2。图中共有384 个节点，2558 条边，其中节点代表中药、活性成分和对应靶点，边代表中药和活性成分以及活性成分和对应靶点的相互作用关系。应用CytoNCA 插件筛选出度值排名前10 的成分，见表1。
表1 七味白术散度值排名前十的活性成分基本信息表
图1 七味白术散与DN的靶点韦恩图
图2 七味白术散“中药-活性成分-靶点”网络图构建
2.2 核心靶点PPI 的构建与分析 将药物和疾病的交集靶点导入STRING 数据平台，进行蛋白互作分析。将tsv 格式文件导入Cytoscape3.7.1 软件，网络图共130 个节点，637 条边，见图3。在PPI 网络中进行拓扑学分析，共筛选得到48 个核心靶点。并以Degree 值降序排序，见图4，筛选得到排序前10 的基因，分别是JUN、MAPK3、TP53、STAT3、MAPK1、RELA、AKT1、TNF、MAPK14、IL6。
图3 七味白术散和DN共同靶点的PPI网络图
图4 筛选得到的48个核心靶点（按照degree值排序）
2.3 GO 功能富集化分析 应用Metascape 网站对筛选得到48 个核心靶点进行GO 富集分析，以显著富集（P＜0.01）为条件共富集得到GO 条目1,260 条，其中生物过程（biological process，BP）1,153 条，主要包括细胞对激素的反应、细胞对脂质的反应、细胞对有机环状化合物的反应等；
分子功能（molecular function，MF）75 条，主要包括RNA 聚合酶II 特异性DNA 结合转录因子结合、DNA 结合转录因子结合、细胞因子受体结合等。细胞组成（cellular component，CC）32 条，主要包括转录调节复合物、膜筏、细胞膜微结构域等；
取-Log（P）值前10 的条目进行可视化分析，其中条形长度代表P值大小，见图5。
图5 七味白术散治疗DN的潜在靶点的GO分析
2.4 KEGG 通路富集分析 将48 个核心靶点导入Metascape 网站进行KEGG 通路富集化分析，以P＜0.01条件得到符合筛选标准的条目173 条。主要涉及到癌症相关通路（Pathways in cancer）、脂质和动脉粥样硬化通路（Lipid and atherosclerosis）、AGE-RAGE 信号通路在糖尿病并发症中的作用（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、JAK-STAT 信号通路（JAKSTAT signaling pathway）、Wnt 信号通路（Wnt signaling pathway）、NF-κB 信 号 通 路（NF-kappa B signaling pathway）、PPAR 信号通路（PPAR signaling pathway）等。按-Log（P）值降序排序，取最大的20 条进行可视化分析，得到气泡图，见图6。由于AGE-RAGE 信号通路与炎症反应和糖尿病并发症密切相关，因此用R 软件加载Pathview 包对其进一步可视化，见图7。
图6 KEGG通路富集分析结果
图7 AGE-RAGE 信号通路在糖尿病并发症中的作用
2.5 分子对接验证 为验证网络分析结果，对度值排名前5 的核心靶点（JUN、MAPK3、TP53、STAT3、MAPK1）及“中药-成分-靶点”网络中度值排名前十的核心成分（槲皮素、山柰酚、芒柄花素、豆甾醇、7-甲氧基-2-甲基异黄酮、柚皮素、β-谷甾醇、异鼠李素、甘草查尔酮a、伊立固酮）进行分子对接。结合能值均＜-5 kcal/mol，表明核心成分和核心靶点对接良好，见表2 和图8。其中β-谷甾醇和MAPK3 的结合能最低，PyMol 可视化结果发现β-谷甾醇能稳定结合在蛋白质活性口袋上，与MAPK3 的LYS-73 残基形成氢键相互作用。取每个核心靶点结合能最低的对接结果进行PyMol 可视化，见图9。
表2 分子对接结果
图8 化合物和核心基因的分子对接热图
图9 分子对接结果
糖尿病肾病是一种常见的糖尿病微血管并发症，由于其预后差、治愈难，已成为威胁糖尿病患者健康的主要原因之一。中医理论认为DN 属于“消渴病”的范畴，其病因在于饮食不节、情志失调和体虚劳损，以虚、瘀、浊为基本病机。大量证据揭示DN 的病理生理机制和氧化应激、炎症反应相关［6］。七味白术散以人参为君药，白术为臣药，茯苓、葛根、藿香、木香共同为佐药，炙甘草为使药，具有健脾益气、生津止渴的功效。符合中医对DN“从脾论治”的理论原则，可用于气阴两虚证型的治疗。研究表明七味白术散是健脾利湿的代表方剂之一，可以有效调控肠道菌群、改善脾胃功能，从而达到治疗糖尿病的目的［7］。一项动物实验发现七味白术散可降低气阴两虚型糖尿病模型大鼠空腹血糖水平，抑制氧化应激反应，改善肾功能［8］，然而其具体的作用机制仍不清楚。
本研究基于“中药-成分-靶点”网络分析，结果发现槲皮素、山柰酚、芒柄花素、豆甾醇成分靶点较多，是七味白术散发挥作用的主要活性成分。槲皮素是一种黄酮类化合物，具有预防和治疗不同疾病的治疗潜力。越来越多的研究证实其具有抗炎、抗菌、抗氧化特性，可抑制炎症细胞浸润，减轻肾脏氧化应激和病理损伤，有效改善DN 患者的肾功能［9］。山柰酚可以改善肾损伤和纤维化，具有减轻氧化应激、抗炎的功效。芒柄花素是一种异黄酮类植物雌激素，可以降低高血糖、减少氧化应激和肾组织损伤从而降低DN 风险。豆甾醇是具有类似于胆固醇结构的天然生物活性植物物质，可以调节糖代谢和胆固醇代谢。这些主要的七味白术散活性成分共同发挥抗炎、抗氧化、抗纤维化、抗高血糖的作用，减轻肾脏病理损伤，实现治疗DN 的药理机制。
PPI 网络分析发现，JUN、MAPK3、TP53、STAT3、MAPK1、RELA、AKT1、TNF、MAPK14、IL6 是 七 味白术散治疗DN 的关键靶点。为进一步揭示七味白术散可能的抗DN 机制，对5 个关键靶点和10 种核心成分进行分子对接，结合能均＜-5 kcal/moL，这表明关键靶点和核心成分结合情况良好，核心成分可以有效发挥作用。其中，JUN 和DN 发病密切相关。研究发现JUN 家族成员之一的c-JUN 是DN 肾纤维化的关键上游因子，影响肾纤维化过程中TGFβ1 的表达［10］。MAPK3（也称为ERK1）已被证实与胰岛素抵抗的发展有关，其在β 细胞中的作用表明MAPK3 活性失调可能在2 型糖尿病的进展中发挥作用［11］。此外，TP53 也被认为和DN发展相关，可通过抑制MAPK 和NF-κB 通路提高胰岛素敏感性［12-13］。
GO 富集分析结果显示，该治疗过程主要涉及细胞对胰岛素的反应、对脂质的反应、蛋白质磷酸化的正调控、细胞死亡的正向调节、miRNA 转录调控等生物过程。KEGG 分析结果提示七味白术散治疗DN 可能是通过AGE-RAGE 信号通路发挥作用。AGE-RAGE 信号通路已被证实与DN 发病密切相关，通过促进肾脏中的炎症和纤维化过程参与DN 的发展，导致肾脏结构的扭曲，并最终导致肾功能丧失［14］，AGEs 在肾脏中的积累与肾小球和肾小管的营养不良以及进行性蛋白尿有关［15］。通路可视化分析发现七味白术散可以作用于通路中大多数靶点发挥作用，减轻DN 肾脏损伤。此外还涉及到JAK-STAT 信号通路和NF-κB 信号通路。最新研究发现药物可以通过调节JAK-STAT 信号通路保护糖尿病大鼠的肾损伤［16］。NF-κB 信号通路介导了较多炎症反应的发生，与Caspase-3 介导的肾组织凋亡细胞死亡有关［17］。此外，高血糖会增加NF-κB 基因的表达，氧化应激通过激活NF-κB 信号触发炎症反应，如炎症细胞浸润和基底膜增厚，最终加剧DN 的肾脏损伤。因此，调节NF-κB 信号通路的抗炎活性可以减轻DN 的发展。GO 和KEGG 分析结果共同揭示了七味白术散作用于DN 是多途径、多过程的，体现了中药方剂中各种药物之间具有协同发挥作用的特性。
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