栾珺 韩锋产
滨州医学院生物化学与分子生物学教研室，山东省医药卫生耳科遗传病重点实验室（烟台 264003）
感音神经性耳聋是世界范围内的多发病，有多种致病因素，主要包括遗传因素、氧化应激、衰老、耳蜗血管变化和环境因素（如噪音、耳毒素、氨基糖苷素等），大部分耳聋伴有耳蜗毛细胞和螺旋神经元的死亡或退化[1]。耳蜗毛细胞(Hair Cells,HCs)的丢失或损伤引起内耳感觉细胞的损伤会导致感音神经性耳聋[2]。迄今为止，已有150 多种基因突变或异常会导致听力损失[3]，高发的遗传性耳聋相关致病基因主要包括GJB2，SLC26A4和MT-RNR1[4]，但仍有很多耳聋相关新基因及新突变有待发掘。
非哺乳类脊椎动物（如鸟类）和斑马鱼侧线具有毛细胞再生能力，毛细胞丢失后，可通过再生毛细胞来恢复受损的听力[5]。两周龄左右的哺乳动物的毛细胞虽自我再生能力有限，但通过调控相关信号通路或基因仍可再生；
而成年哺乳动物的毛细胞和支持细胞(Supporting Cells,SCs)已达到最终分化状态，其毛细胞损伤将导致不可逆转性听力损失，进而造成永久性感音神经性听力丧失[6]。
Atonal homolog 1(Atonal homolog 1,Atoh1)对耳蜗毛细胞和耳蜗核(Cochlear Nuclei)的发育至关重要[7]，其通过与多种信号转导通路的相关分子共同作用以驱动毛细胞的再生。本文综合论述了Atoh1调控毛细胞再生与诱导干细胞分化毛细胞的研究进展，探讨通过调控Atoh1 基因的表达以修复毛细胞损伤所致听力障碍的新途径。
Atoh1基因是果蝇原核基因Atonal的同源物。在小鼠Atoh1基因又称为Math1基因，在人称为HATA1基因[8]。该基因含一个外显子，无内含子，编码序列长度为1.053Kb[9]；
编码产物Atoh1 是一转录因子，由354个氨基酸组成[10]，分子量为37.9kDa，具有高度保守长度约为56 个氨基酸残基的basic Helix-Loop-Helix(basic Helix-Loop-Helix,bHLH)模体[9]，被认为是毛细胞分化的关键启动因子。
毛细胞的形成可以通过HCs 的分化、SCs 的有丝分裂或SCs 的转分化来实现，其形成与发育依赖于Atoh1 的表达。研究发现，在转基因小鼠中，Atoh1 先在小鼠胚胎发育初期的耳蜗底部附近表达，在E13.5 到E17.5 时到达峰值。在出生后的第1周，Atoh1 表达相比于E17.5 显著减少；
到出生后第6 天(Postnatal day 6,P6)，Atoh1 几乎不表达；
在P1-6期间，Atoh1可诱导SCs转分化为未成熟的HCs。但随着小鼠周龄的增加，SCs 转分化为HCs 的能力逐渐消失，在2周左右完全丧失[11]。
Atoh1 能够协调细胞命运，调节细胞周期和增殖。研究发现，在Atoh1基因表达过的小鼠模型中，Atoh1基因能够使内耳祖细胞分化为毛细胞并调控毛细胞的分化及活性[12]；
在Atoh1基因敲除的小鼠模型中，哺乳动物将失去形成耳蜗毛细胞和前庭毛细胞的能力[13]。
Shuting Li 等[14]研究发现Atoh13*HA-P2A-Cre小鼠是研究毛细胞分化的理想遗传模型。陈志婷等[15]选用重组腺病毒-Math1-EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)，优化体外转染条件，转染293T 细胞，发现重组腺病毒载体介导的细胞转染率达到了94%。Li W 等[16]采用一种新型耳蜗外植体培养系统（包括感觉上皮和周围的骨结构），以携带CMV 启动子驱动的人ATOH1(Ad-Atoh1)腺病毒感染培养的Atoh1-GFP 转基因成年小鼠耳蜗，在转基因小鼠耳蜗外植体中检测到大量Myo7a+、Pvalb+的表达，证明Atoh1基因过表达可促进SCs 转分化为HCs。
2.1 Atoh1与其上下游调控基因共同作用来驱动毛细胞再生与分化
Atoh1 在内耳毛细胞分化中起重要作用，Sox2、Eya1和Six1是Atoh1 上游调控基因，Gfi1、Pou4f3和Barhl1是Atoh1下游调节基因。
Sox2 是具有HMG 结构域的转录因子，在胚胎和各种器官的祖细胞以及发育和成熟的神经系统中广泛表达,可通过刺激Atoh1 的表达以促进毛细胞的形成[17]。Kempfle JS 等[18]利用Sox2-Cre-ER;Sox2flox/flox条件性敲除小鼠Sox2 基因，发现在感觉祖细胞(Sensory Progenitors) 形成后，Sox2基因的缺失能够阻断毛细胞分化，表明Sox2 不仅是形成感觉祖细胞的必要条件，而且是感觉祖细胞分化为毛细胞所必需的。
Eya1/Six1主要参与耳的早期发育，是形成耳蜗和诱导Sox2 表达所必需的。Ahmed M 等[19]的研究结果表明，在小鼠耳蜗外植体中，Eya1/Six1 可以通过激活Atoh1 依赖途径及非依赖的途径，诱导Sox2低表达的非感觉上皮中的毛细胞再生。Sox2 与Eya1/Six1 共表达，通过直接结合Atoh1基因3"端增强子，上调Atoh1表达，从而决定毛细胞命运。
Gfi1基因在耳蜗毛细胞发育时开始表达，Gfi1基因缺失会导致胚胎耳蜗毛细胞无法发育成完全功能的成熟耳蜗毛细胞。Lee S等[20]研究发现，与单独的Atoh1基因表达相比，Atoh1与Gfi1基因共表达导致4 周后新的毛细胞样细胞(HC-Like Cells,HCLC)增加了6.2 倍，在整个耳蜗中检测到了新的HCLC，其未成熟的静纤毛存活至少8周。
Pou4f3 能控制毛细胞的分化、成熟及存活[21]。在Walters BJ 等[22]的相关研究中发现，在成年小鼠，与单独的Atoh1基因表达相比，Pou4f3和Atoh1基因联合表达可使更多的SCs 转化为HCs。Costa等[23]同样发现Atoh1基因单独表达不能诱导毛细胞再生，而与Pou4f3和Gfi1基因联合表达后，无论在体外还是在体内都能够有效地促进小鼠胚胎干细胞(mouse Embryonic Stem Cells,mESCs)分化成毛细胞样细胞。
Barhl1 在内耳高度表达，对于介导听力和平衡之听觉毛细胞的持续生存至关重要[24]。Barhl1基因是毛细胞中Atoh1潜在的靶点，Atoh1与位于3"端增强子的E3 位点结合以激活Barhl1基因的表达，从而驱动前感觉细胞分化为新生毛细胞[25]。Menendez L 等[26]研究证实Barhl1基因的靶向敲除虽不影响mESCs 向早期原始外胚层样细胞和耳祖细胞的分化，但强烈抑制毛细胞样细胞的分化。
正常毛细胞发育是否成功在于听觉毛细胞的成熟和维持。Atoh1通过与以上因子共同作用来驱动毛细胞的分化与成熟，这为我们提供了另一种基因治疗的方法。
2.2 调控Atoh1相关信号转导通路与毛细胞再生
Notch、Wnt/β-catenin、Sonic Hedgehog(Sonic Hedgehog,SHH)及Fibroblast Growth Factor(Fibroblast Growth Factor,FGF)等相关信号转导通路是耳蜗发育过程中决定前感觉细胞增殖和细胞命运的重要途径。抑制Notch 信号通路或促进Wnt/βcatenin、SHH 或FGF 信号通路，都是毛细胞再生的有效的方法。Notch 信号通路可通过抑制Atoh1基因表达来抑制毛细胞增殖及分化。当Notch信号分子与Jag2 和Deltal（Notch 信号配体）结合后，NICD(Notch1 Intracellular Domain)从膜中释放，通过上调Atoh1 基因的抑制因子Hes1 及Hes5，阻断Atoh1 的表达，进而抑制毛细胞及支持细胞的增殖与分化[27]。有研究发现，可以采用γ-分泌酶抑制剂以抑制Notch 信号通路，从而促进毛细胞和支持细胞的增殖与分化[28]。Wnt/β-catenin 信号通路的激活能够抑制细胞的凋亡,减少毛细胞的损伤,甚至促进毛细胞增殖与再生[29]。β-catenin 是一种多功能连环蛋白，在Wnt信号的激活下，可从胞浆进入胞核，形成β-catenin/Tcf 复合物，驱动Wnt 靶基因表达，进而促进毛细胞的再生。有研究表明，β-catenin 与Atoh1基因3"端增强子相互作用可介导新生耳蜗Lgr5+细胞亚群的增殖和分化，从而克服成年哺乳动物毛细胞无法再生的缺陷[30]。SHH 信号通过上调Atoh1-Brn3.1 信号转导途径，促进耳蜗神经祖细胞的分化。在SHH 信号刺激下，Atoh1 可以调节颗粒神经祖细胞(Granular Neural Progenitor cells,GNPs)中SHH 依赖性增殖并诱导其分化；
Gli1是SHH 信号通路的下游基因，在没有SHH 信号的情况下，Atoh1 基因的过度表达不能支持GNPs 的增殖[31]。FGF 负调控Atoh1 的表达，从而防止毛细胞的过早分化。其主要是通过激活SHH 信号通路，维持Notch 效应物Hey1、Hey2 的表达水平[27]。FGF 信号能控制前感觉细胞在耳蜗发育过程中向毛细胞和支持细胞的分化[32]。FGF 信号的共同选择可能会使支持细胞无需与周围的毛细胞直接接触，实现内耳复杂细胞镶嵌的进化与重塑[33]。
干细胞能分化为各种不同类型的组织细胞，具有分化毛细胞的潜能。近期研究表明，骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)具有高扩增、遗传稳定、易于分离培养、低免疫源性和免疫调节等功能，可促进神经组织修复[34]。Kazuo等[35]研究发现BMSCs 在适宜条件下可诱导生成HCLCs，并检测到毛细胞标志物MyosinⅦA的表达；
Lopez-Juarez,A 等[36]通过耳蜗造孔术法把Atoh1-GFP 表达小鼠的外毛细胞祖细胞(Outhair Progenitor Cells,OPCs)移植入成年耳毒性模型豚鼠前庭室，发现移植的耳祖细胞可以存活并迁移到耳蜗感觉上皮，其中一些细胞开始分化为表达标记蛋白的耳感觉细胞。Zhang YL 等[37]发现，人脂肪来源的间充质干细胞具有分化为人毛细胞祖细胞的潜力，小的活化RNA(small activating RNA,saRNA)能够靶向作用于ATOH1基因并上调其表达；
将能够有效、持续激活ATOH1基因表达的saRNA 转染到毛细胞祖细胞中，10 天后成功检测到内耳毛细胞特征性标志物Pou4f3和Myo7a的表达。
Atoh1 是bHLH 转录因子家族中的一员，表达于耳蜗毛细胞，调控毛细胞的再生与分化。Atoh1可与其上下游调控分子相互作用，调节多种细胞信号转导通路，诱导耳蜗毛细胞的再生。目前，针对Atoh1基因的毛细胞再生实验虽已取得一定的效果，但仍然处于初级阶段。在未来，靶向调控耳祖细胞或干细胞的Atoh1及其相关基因，将为毛细胞损害的临床治疗提供新途径。
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