刘 琪,曹影丽,魏宁波,杨侃侃,梁月巧,宋祥军,邵 颖,涂 健,祁克宗
(兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室,安徽省动物性食品质量与生物安全工程实验室,安徽 合肥 230036)
天然免疫系统是机体抵抗病原体感染的第一道防线,病原体入侵宿主细胞后其病原相关分子模式(PAMPs)会被模式识别受体(PRRs)识别并活化,引起机体发生先天免疫应答产生干扰素(IFN)、干扰素诱导基因与炎症因子,从而抑制病毒复制,发挥抗病毒的天然免疫功能[1-3]。Zhang等[4]在2011年首次证实DDX41作为一种DNA感受器识别DNA病毒激发天然免疫。DDX41是胞质内含DEXDc框的RNA解旋酶家族成员蛋白,仅由1个DEXDc、1个HELICc(carboxy-terminal helicase)和1个Zn F-C2HC(Zinc finger-Cys Cys His Cys)结构域构成[5-7]。DDX41基因编码的蛋白质在不同物种基因组中高度保守且广泛分布在各组织系统中。另有研究表明,DDX41基因在鱼类、鼠、猪和鸭中均表现出DNA感受器的功能,可以激发天然免疫、产生Ⅰ型干扰素,抵抗病毒感染[8-11]。
2017年Cheng等[12]首次克隆chDDX41基因,并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、shRNA、poly(I:C)与poly(dA:dT)刺激等实验证明chDDX41是鸡体内一种重要的DNA感受器,通过qRT-PCR、免疫共沉淀(CO-IP)等进一步证明了chDDX41与chSTING有很强的相互作用,参与DNA病毒介导的chDDX41-chSTING-IFN-β的天然免疫通路。禽腺病毒4型(FAdV-4)是属于腺病毒科腺病毒属一种无囊膜的双股DNA病毒,是引起心包积液、出血性肝炎和肌胃糜烂等症状的主要病原体[13-16]。FAdV-4作为一种DNA病毒是否会引起chDDX41介导的天然免疫机制目前尚未见报道。
本研究通过克隆chDDX41基因,构建pET-32a-chDDX41、pCAGGS-HA-chDDX41、pCMV-3×Flag-chDDX41、pmCherry-chDDX41重组表达质粒,利用原核表达系统对pET-32a-chDDX41重组蛋白进行表达纯化;利用激光共聚焦技术探究chDDX41蛋白在鸡肝癌细胞(LMH)、鸡巨噬细胞(HD11)中的亚细胞定位;在mRNA水平上探索chDDX41是否会诱导细胞因子的表达进而影响FAdV-4的复制,为进一步研究chDDX41在免疫调节中的作用奠定基础。
1.1 病毒、细胞与质粒
FAdV-4 AH-F19株,LMH和HD11细胞,pET-32a、pCMV-3×Flag-N、pCAGGS-HA和pmCherry-C1空载质粒均由安徽农业大学兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室登记保存;大肠埃希菌感受态细胞DH5a、BL21(DE3)均购买于吐露港生物科技有限公司。
1.2 主要试剂
2×TaqMaster Mix(DYE Plus)、ClonExpress®ⅡOne Step Cloning Kit均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司;Lipo8000TM、Lipo6000TM转染试剂均购自上海碧云天生物技术有限公司;EcoRⅠ、KnpⅠ、HindⅢ、BamHⅠ限制性内切酶均购自宝日医生物技术有限公司;SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒、ECL显色液均购自生工生物工程(上海)股份有限公司;普通质粒提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司;去内毒素质粒DNA小量提取试剂盒购自简石生物;蛋白纯化试剂盒购自康为世纪生物科技股份有限公司;6×His Tag Mouse MCAb购自Proteintech Group, Inc.;Anti-DYKDDDDK-Tag Antibody AF594购自艾比玛特医药科技(上海)有限公司;HA-Tag、Rabbit pAb兔抗HA-Tag多克隆抗体、Flag-Tag(DYKDDDDK)Rabbit pAb购自翌圣生物科技(上海)股份有限公司;Goat anti Mouse IgG、Goat anti Rabbit IgG购自成都正能生物科技有限责任公司。
1.3 chDDX41基因引物设计与克隆
按照GenBank中登录号为NM_001349708.2的chDDX41基因序列设计1对特异性引物chDDX41-F/chDDX41-R。引物序列见表1。引物均在通用生物系统(安徽)有限公司合成。按照SPARKeasy细胞RNA快速提取试剂盒说明书提取LMH细胞总RNA,并将其反转录为cDNA作为RT-PCR的模板,用chDDX41-F/chDDX41-R特异性引物进行PCR扩增,PCR扩增体系:2×TaqMaster Mix(DYE Plus) 10 μL、上游引物(10 mmol·L-1)1 μL、下游引物(10 mmol·L-1)1 μL、DNA模板1 μL,用ddH2O补至20 μL。反应程序:95℃ 3min;95 ℃ 15s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 60s,30～35个循环;72 ℃ 5 min。PCR原液送至南京擎科生物科技有限公司进行测序。
表1 PCR扩增的特异性引物Table 1 Specific primers for PCR
1.4 重组质粒的构建
利用CE Design软件设计chDDX41基因的同源臂引物,引物依次命名为pET-32a-chDDX41-F/R、pCAGGS-HA-chDDX41-F/R、pCMV-3Flag-chDDX41-F/R、pmCherry-chDDX41-F/R,引物具体序列见表1。以凝胶纯化产物为模板,用同源臂引物进行扩增纯化后分别与酶切的pET-32a、pCAGGS-HA、pCMV-3×Flag-N和pmCherry-C1空载质粒进行同源重组。酶连产物立即转化到大肠埃希菌DH5a中过夜培养。挑选单菌落扩大培养后进行菌液PCR验证,将阳性菌液送至南京擎科生物科技有限公司进行测序,获得含有目的片段的阳性重组子依次命名为pET-32a-chDDX41、pCAGGS-HA-chDDX41、pCMV-3×Flag-chDDX41、pmCherry-chDDX41。
1.5 pET-32a-chDDX41重组蛋白的表达、纯化与可溶性分析
分别将测序结果正确的pET-32a(+)-chDDX41重组质粒和pET-32a(+)空载体划转到大肠埃希菌BL21(DE3)中过夜培养,挑取阳性菌株分别转入含氨苄青霉素(100 μg·mL-1)的LB培养基中,37 ℃ 180 r·min-1振荡培养到吸光度D600为0.4～0.6。加入IPTG进行诱导表达。诱导结束后低温高速离心收集菌体,用提前预冷的PBS重悬菌体,重复上述步骤3次。按照1:10加入PBS重悬处理好的菌体,用超声波破碎仪破碎。菌液破碎至透明后4 ℃ 10 000×g离心30 min,分别取上清液与包涵体进行SDS-PAGE验证并分析目的蛋白质的可溶性。使用CWBIO蛋白纯化试剂盒纯化上述离心后的上清液,纯化后的产物用SDS-PAGE凝胶电泳验证。
1.6 pET-32a-chDDX41重组蛋白Western blot鉴定
pET-32a-chDDX41重组蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳后湿转至PVDF膜,用5%脱脂奶粉在37 ℃培养箱中封闭5 h,封闭结束后用PBST洗3次。将6×His Tag Mouse MCAb按照1∶8 000稀释作为一抗,在37 ℃培养箱中孵育1.5 h,一抗孵育结束后用PBST洗3次。再将Goat anti Mouse IgG按照1∶5 000稀释作为二抗,在37 ℃培养箱中孵育1 h,二抗孵育结束后用PBST洗3次。配制ECL显色液避光显色。
1.7 chDDX41细胞定位
将处于对数生长期的LMH和HD11细胞分装至铺有爬片的12孔细胞板中,待细胞密度达到85%～90%时分别将pCMV-3×Flag-chDDX41、pCAGGS-HA-chDDX41和pmCherry-chDDX41真核表达质粒分别转染至LMH和HD11细胞中,转染24 h后进行IFA(间接免疫荧光)。IFA结束后,加入含有封片剂的DAPI染色液进行染色,室温孵育5 min即制片结束。转染pmCherry-chDDX41重组质粒的细胞仅进行固定、通透、封闭和DAPI染色即可。制片结束后用激光共聚焦显微镜观察chDDX41蛋白在LMH和HD11中的亚细胞定位。
1.8 siRNA转染LMH细胞
将处于对数生长期且状态佳的LMH细胞分装至6孔细胞板中,待细胞密度达到90%～100%时将pCMV-3×Flag-chSTING真核表达质粒转染至LMH细胞中,24 h后将由南京擎科生物科技有限公司合成的3对靶向chSTING基因的siRNA转染至LMH细胞中,通过Western blot结合灰度分析筛选最佳siRNA。随后用FAdV-4感染同时过表达chDDX41和用siRNA敲低chSTING的LMH细胞,通过Western blot在蛋白质水平分析chDDX41对FAdV-4复制的影响。
1.9 qRT-PCR
将pCMV-3×Flag-chDDX41与pCMV-3×Flag-N空载质粒分别转染到LMH细胞中,用FAdV-4感染。以感染16 h后提取的LMH细胞总RNA反转录成的cDNA为模板,按照试剂说明书进行qRT-PCR实验,以β-actin为内参,利用2-ΔΔCT法计算感染FAdV-4后LMH细胞中IFN-β、IL-6、IL-8、IL-1β、MX-1、MYD88、IRF7、TBK1、MDA5、NF-κB和PKR在转录水平的变化。引物序列见表1。
1.10 数据分析
使用SPSS 16.0软件进行统计和分析,组间比较采用方差分析,设置检验水准为0.05,可视化使用GraphPad Prism 8软件。本研究所有实验均重复3次。
2.1 chDDX41基因克隆
PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后,用凝胶成像仪观察可见1条约1 854 bp的特异性条带(图1),切胶纯化后送至南京擎科生物科技有限公司进行测序,结果与预期一致,无基因突变。
M,DL2000 marker;1,chDDX41基因PCR产物;2,阴性对照。M, DL2000 marker; 1, PCR product of chDDX41 gene; 2, Negative control.图1 chDDX41基因扩增产物Fig.1 PCR product of chDDX41gene
2.2 重组质粒的酶切鉴定
使用限制性内切酶双酶切重组质粒pET-32a-chDDX41、pmCherry-chDDX41、pCMV-3×Flag-chDDX41、pCAGGS-HA-chDDX41,产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析,依次出现pET-32a、pmCherry-C1、pCMV-3×Flag和pCAGGS-HA空载体条带和大小约1 854 bp的chDDX41基因条带(图2),表明重组质粒构建成功,并将重组质粒送至南京擎科生物科技有限公司进行测序,结果与预期一致,无基因突变。
M,DNA marker(A,1 kb plus DNA ladder;B-C,DL5000)。1,pET-32a(+)-chDDX41重组质粒酶切产物;2,pmCherry-chDDX41重组质粒酶切产物;3,pCMV-3×Flag-chDDX41重组质粒酶切产物;4,pCAGGS-HA-chDDX41重组质粒酶切产物。M:DNA marker(A, 1 kb plus DNA ladder; B-C, DL5000). 1, pET-32a(+)-chDDX41 recombinant plasmid digested product; 2, pmCherry-chDDX41 recombinant plasmid digested product; 3, pCMV-3×Flag-chDDX41 recombinant plasmid digested product; 4, pCAGGS-HA-chDDX41 recombinant plasmid digested product.图2 重组质粒的酶切鉴定Fig.2 Enzyme digestion identification of recombinant plasmids
2.3 重组蛋白的表达与可溶性分析
pET-32a-chDDX41重组蛋白在15 ℃、IPTG终浓度为0.5 mmol·L-1条件诱导表达19 h,收集菌体并经SDS-PAGE验证,在90 ku左右出现明显条带并且在上清和包涵体中均有表达(图3),说明重组蛋白具有可溶性,与预期结果一致。
M,10～250 ku marker;1～2, 15 ℃ pET-32a空载体未诱导、诱导产物;3～4, 15 ℃ pET-32a-chDDX41重组蛋白未诱导、诱导产物;5～6, 15 ℃诱导19 h pET-32a-chDDX41重组蛋白的包涵体、上清液。M, 10-250 ku marker; 1-2, Not induced and induction products of pET-32a empty vector at 15 ℃; 3-4, Not induced and induction products of pET-32a-chDDX41 recombinant protein at 15 ℃; 5-6, Induction of inclusion bodies and supernatants of pET-32a-chDDX41 recombinant protein at15 ℃for 19 h.图3 pET-32a-chDDX41重组蛋白SDS-PAGE验证结果Fig.3 SDS-PAGE verification of pET-32a-chDDX41 protein
2.4 pET-32a-chDDX41重组蛋白的纯化
使用试剂盒对重组蛋白pET-32a-chDDX41进行纯化,在咪唑浓度为500 mmol·L-1时目的蛋白被成功洗脱(图4)。
M,10-250 ku marker;1,pET-32a-chDDX41重组蛋白在15 ℃的诱导产物;2,15 ℃诱导19 h pET-32a-chDDX41重组蛋白的包涵体;3,15 ℃诱导19 h pET-32a-chDDX41重组蛋白的上清;4～5,流穿液;6～7,洗涤液;8～10,洗脱液。M, 10-250 ku marker; 1, Induction product of pET-32a-chDDX41 recombinant protein at 15 ℃; 2, Inclusion body of pET-32a-chDDX41 recombinant protein induced at 15 ℃ for 19 h; 3, Supernatant expression of pET-32a-chDDX41 recombinant protein induced at 15 ℃ for 19 h; 4-5, Flow-through fluid; 6-7, Detergent; 8-10, Elution solution.图4 pET-32a-chDDX41重组蛋白的纯化Fig.4 Purification of pET-32a-chDDX41 recombinant protein
2.5 重组蛋白的Western-blot验证
Western-blot验证结果表明,诱导后的pET-32a-chDDX41重组蛋白在90 ku左右出现一条特异性条带(图5),与预期结果一致,说明诱导出的pET-32a-chDDX41重组蛋白即为目的蛋白。
1,特异性条带;M,10～250 ku marker。1, Specific band; M, 10-250 ku marker.图5 pET-32a-chDDX41重组蛋白Western-blot验证Fig.5 Western-blot validation of pET-32a-chDDX41 recombinant protein
2.6 chDDX41的亚细胞定位
将真核表达质粒pmCherry-chDDX41、pCAGGS-HA-chDDX41、pCMV-3×Flag-chDDX41分别转染到LMH细胞中,将真核表达质粒pmCherry-chDDX41和pCAGGS-HA-chDDX41分别转染到HD11细胞中,转染24 h后进行IFA和DAPI染色,然后用激光共聚焦显微镜观察,结果均显示chDDX41定位在细胞核中(图6、图7)。
A-C, pmCherry-chDDX41; D-F, FITC-chDDX41; H-J, AF594-chDDX41.图6 chDDX41在LMH细胞中的定位Fig.6 Subcellular localization of chDDX41 in LMH cells
A-C, pmCherry-chDDX41; D-F, FITC-chDDX41.图7 chDDX41在HD11细胞中的亚细胞定位Fig.7 Subcellular localization of chDDX41 in HD11 cells
2.7 FAdV-4对过表达chDDX41基因的LMH细胞中细胞因子表达量的影响
如图8所示,用FAdV-4感染过表达chDDX41的LMH细胞16 h后,细胞中的IFN-β、IL-6、IL-8、IL-1β、MX-1、MYD88、IRF7、TBK1、MDA5、NF-κB和PKR在mRNA水平上表达量均上调。
1,转pCMV-3×Flag-N空载质粒的LMH细胞;2,转pCMV-3×Flag-chDDX41质粒的LMH细胞。1, LMH cell transformed with empty plasmid pCMV-3×Flag-N; 2, LMH cell transformed with plasmid pCMV-3×Flag-chDDX41.图8 过表达chDDX41对细胞因子表达量的影响Fig.8 Effect of overexpression of chDDX41 gene on cytokine expression
2.8 siRNA干扰影响FAdV-4复制
通过siRNA敲低chSTING反向验证chDDX41对FAdV-4复制的影响,将3对靶向chSTING基因的siRNA转染至LMH细胞,然后感染FAdV-4。利用灰度分析chDDX41对FAdV-4复制的影响,结果如图9所示。siSTING-2的干扰效率最高,可达66%,siRNA敲低chSTING后,过表达chDDX41使FAdV-4-Hexon的蛋白表达量上调20%,这个结果反向证实了chDDX41确实参与鸡体内天然免疫信号通路,是影响FAdV-4复制的关键因子。
A,siRNA引物筛选。B,FAdV-4-Hexon蛋白表达;1,对照;2,转pCMV-3×Flag-chSTING质粒的LMH细胞;3,同时过表达chDDX41基因和用siRNA敲低chSTING基因的LMH细胞。A, Screening of siRNA primers. B, FAdV-4-Hexon protein expression; 1, Control; 2, LMH cell transformed with plasmid pCMV-3×Flag-chSTING; 3, LMH cell overexpressing chDDX41 gene and knocking down chSTING gene simultaneously.图9 siRNA干扰影响FAdV-4复制Fig.9 siRNA interference affects FAdV-4 replication
在病原体感染细胞后,DDX41作为一种DNA感受器被酪氨酸激酶(BTK)磷酸化,磷酸化的DDX41可以与STING结合并使之活化,活化后的STING能招募TBK1磷酸化IRF3,产生IFN,影响病原体复制[9, 17-19]。chDDX41与FAdV-4之间的关系目前还未见报道。chDDX41基因全长2 930 bp,共包含33 bp的5′UTR、1 043 bp的3′UTR和1 854 bp的开放阅读框(ORF),本研究成功克隆出chDDX41的ORF。chDDX41基因共编码617个氨基酸残基,共有282个α折叠、37个β转角[20]。chDDX41蛋白质分子量约为79 ku。本研究利用大肠埃希菌表达系统对chDDX41蛋白进行原核表达,经SDS-PAGE和Western Blot验证,15 ℃、0.5 mmol·L-1IPTG诱导19 h是最佳诱导条件,重组蛋白在上清液和包涵体中均有表达且蛋白具有可溶性。进一步利用柱层析蛋白纯化方法成功纯化出chDDX41重组蛋白,可为后续研究chDDX41基因的功能奠定基础。
Hu等[8]证明在CIK细胞中DDX41定位在细胞核,本研究结果与此一致,表明DDX41在不同物种中的定位具有高度保守性。此外,在Hu等[8]的研究中发现,DDX41在草鱼出血病毒(GCRV)的刺激下可发生核质转运,与STING互作,从而促进IFN的表达,发挥抗病毒的作用,这一结果提示我们后续可通过FAdV-4刺激,观察chDDX41在不同时间点的细胞定位,进一步探索chDDX41在天然免疫信号通路中的功能。近年来关于DDX41介导的天然免疫信号通路被广泛解析,如Zhu等[10]研究证明,DDX41可以激活IRF3和NF-κB,促进IFN的表达,影响伪狂犬病毒复制;Liu等[21]证实,在GS细胞中DDX41可以促进IFN、IRF3,以及细胞因子IL-8和IL-1β的表达,影响石斑鱼彩虹病毒(SGIV)的复制。FAdV-4作为一种DNA病毒,chDDX41是否可以识别FAdV-4从而引发天然免疫目前还未有报道。本研究通过qRT-PCR证明,过表达chDDX41的LMH细胞感染FAdV-4后,其IFN-β、IL-6、IL-8和IL-1β的表达量均上调,这与前人的研究结果一致[10, 21],表明chDDX41可以识别FAdV-4,诱导机体产生天然免疫并具有一定的免疫调节功能。
综上所述,本研究利用大肠埃希菌表达系统首次获得chDDX41原核表达蛋白,利用激光共聚焦显微镜证明chDDX41定位在细胞核中;FAdV-4感染过表达chDDX41的LMH细胞后IFN和细胞因子在mRNA水平上的表达量均上调,证明chDDX41参与FAdV-4感染引起的天然免疫信号通路,为今后探索chDDX41影响FAdV-4感染的具体分子机制奠定了基础。
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