梁妃爽,梁华芳,黄佳宇,王潘妹,温崇庆
(广东海洋大学 水产学院,广东 湛江 524088)
RNA干扰(RNA interference,RNAi)又称RNA敲除或RNA沉默,由21～23 bp的小RNAs(siRNA)介导在转录或者转录后水平能对物种高度保存的mRNA进行靶向切割,进行高效特异性降解[1-3]。其中微RNA(microRNA,miRNA),在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA,其大小长约20～25个核苷酸[4]、piRNA也称Piwi 蛋白(治疗蛋白)互相作用的RNAs[5],和小干扰RNAs(siRNA) 存在于真核生物细胞核和细胞质中,它们的长度为100到300个碱基(酵母中最长的约1 000个碱基),它们由RNA聚合酶Ⅱ或RNA聚合酶Ⅲ所合成[6]。RNA干扰由miRNA、piRNA和siRNA三种形式存在于多细胞动物中[7-9],其原理是通过Dicer酶把dsRNA切割成21～23 bp的siRNA,再通过siRNA作用于靶mRNA并使其降解,这个过程分为起始阶段、效应阶段和扩增阶段[10]。
RNAi技术已经广泛应用在线虫、小鼠、斑马鱼和果蝇等生物中,近年来在甲壳动物中也取得了许多研究成果。从免疫、生长发育、蜕皮、生殖、性别调控、渗透压调节和代谢等方面均有所研究。生长发育方面有日本沼虾(Macrobrachiumnipponense)[11]、斑节对虾(Penaeusmonodon)[12]、凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)[13]、罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)[14]和明钩虾(Parhyalehawaiensis)[15]等;蜕皮方面有红螯螯虾(Cheraxquadricarinatus)[16]、日本沼虾[17]、中国对虾(Fenneropenaeuschinensis)[18]、凡纳滨对虾[19]和蓝蟹(Callinectessapidus)[20]等;生殖方面有美洲龙虾(Homarusamericanus)[21]、刀额新对虾(Metapenaeusensis)[22]、拟穴青蟹(Scyllaparamamosain)[23]和滨蟹(Carcinusmaenas)[24]等;性别调控方面有罗氏沼虾[25]和日本沼虾[26]等;渗透压调节方面有南方滨对虾(Litopenaeusschmitti)[27]等;代谢方面有细角滨对虾(Litopenaeusstylirostris)[28]等;免疫方面有凡纳滨对虾[29]、斑节对虾[30]和日本囊对虾(Marsupenaeusjaponicus)[31]等。综上所述RNA干扰技术已经广泛应用在甲壳动物的方方面面,大大加快了甲壳动物基因功能的研究,但在龙虾方面的研究鲜见报道,如小龙虾、螯虾[16,21]和扁虾[32]有报道,波纹龙虾仅见罗嘉俊[33]的报道,为波纹龙虾基因功能的研究提供了资料参考。
组织蛋白酶C (Cathepsin C, Cat C)是一种溶酶体半胱氨酸蛋白酶,属于木瓜蛋白酶超家族。它能够依次从底物的氨基末端去除二肽[34]。Cat C首先被合成为无活性的前体,然后通过非催化性切除来激活N端前肽,从而形成有活性的成熟的蛋白酶[35]。已有研究证明,Cat C能在人类和小鼠的肺部、肝脏和脾脏组织中高表达,在哺乳动物的各个组织中也可以检测到Cat C的活性,特别是在成熟的骨髓细胞、淋巴细胞和肥大细胞等免疫细胞中高浓度存在[36]。Cat C的主要功能有蛋白质降解、酶原激活和免疫调节作用,在许多免疫/炎症细胞中是许多丝氨酸蛋白酶的调控因子。参与细胞内蛋白降解,血细胞因子ⅩⅢ的激活,神经氨酸酶的激活,还参与了细胞生长和卵母细胞的成熟过程[37-38]。近几年,组织蛋白酶成为水生甲壳动物研究领域中的一个热点,但在虾蟹类中对Cat C的研究相对较少,仅见在斑节对虾、中华绒螯蟹、中国明对虾、凡纳滨对虾和日本囊对虾中有相关报道,如Qiu等[39]报道了斑节对虾在脂多糖(LPS)刺激下CatC基因会激烈上调;Li等[40]成功从中华绒螯蟹血细胞中分离了Cat C,证明Cat C参与了无脊椎动物的先天免疫;Wang等[35]发现Cat C可能对对虾的抗病毒免疫反应有重要作用;林诗天[38]克隆了凡纳滨对虾Cat C和进行溶藻弧菌攻毒实验研究了Cat C的免疫功能;邱高峰等[37]测定了日本囊对虾卵母细胞中Cat C的活性,推测Cat C可能与受精时皮质棒的释放以及受精卵外胶膜的形成有关。即便如此,甲壳动物研究中可供参考的CatC基因信息还是很少,在未来的研究中还处于初级阶段。
TLR13(Toll like receptor 13)基因是一种 TLR 模式识别受体基因,属于TLR11家族,研究表明TLR13在机体抵抗细菌、真菌、病毒和寄生虫的感染过程起重要的作用[41]。PhCatC1/2是溶酶体通路的半胱氨酸组织蛋白酶基因,PhLys是溶菌酶基因,Phβ-G是β-葡萄糖醛酸酶基因,PhLys和Phβ-G均是溶酶体酶基因和抗菌蛋白基因,在波纹龙虾免疫系统中发挥着重要作用。波纹龙虾缺乏脊椎动物的特异性免疫防御机制,依靠细胞和体液产生的免疫因子构成自身的非特异性免疫。溶菌酶是波纹龙虾体液免疫中一类重要的非特异性免疫因子,在抵御细菌入侵,引发、维持机体免疫防御中发挥重要作用[42]。PhCatC1/2是溶菌酶的一份子,本实验克隆PhCatC1/2的基因进行生物信息学分析发现该基因均含有一个Pept_C1结构域,均只有一个N-糖基化位点,但不同点是PhCatC1只有1个(low complexity)结构域,PhCatC2有2个(low complexity)结构域。但这两个亚型基因的具体作用方式和不同之处还需更加深入研究。PhCatC1/2是否对溶酶体相关免疫基因有作用或者对Toll样受体相关基因有所影响尚未知道。本研究通过体内注射dsRNA-PhCatC1和dsRNA-PhCatC2,利用qPCR检测目的基因双链RNA对PhTlr13、PhLys和Phβ-G基因的影响,为波纹龙虾及其他甲壳动物CatC基因功能和相关免疫研究提供参考。
1.1 实验材料与试剂
波纹龙虾购自海南省琼海市青葛村,开展实验前挑选平均体重为(128.0±0.5) g的波纹龙虾在盐度为26～30,pH值为8.1～8.3的1 m3黑色PVC桶中暂养,期间用黑色幕布遮光,每天换水50%和清理残余饵料。实验开始前没有随机抽取试验虾进行相关病毒及弧菌感染检测实验,开始前挑选健康活泼的波纹龙虾放入黑色PVC桶中暂养,期间每天09:00换水,及时清理饵料粪便和残渣以及脱掉的外壳,保证波纹龙虾有个健康的养殖环境以确保实验用虾不存在病原体感染。养殖3周后开始RNA干扰实验,取波纹龙虾的肝胰腺组织迅速切碎保存于RNAlater中,4 ℃过夜后保存于-80 ℃备用。
Plasmid Mini Kit质粒小量快速提取试剂盒产自艾德莱生物有限公司;RNA提取试剂盒Trizol、cDNA 反转录试剂盒TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA、荧光定量PCR试剂盒PerfectStartTMGreenqPCRSuperMix、PBS、T7 High Efficiency Transcription Kit试剂盒、胶回收试剂盒、纯化试剂盒和普通PCR试剂盒均购自北京全式金生物有限公司。
1.2 引物设计
从波纹龙虾全长转录组数据库中找出PhCatC1/2、PhTlr13、PhLys和Phβ-G基因,以β-actin为内参基因,用Primer 5.0 软件设计引物,分别在引物上下游的5′加上T7启动子序列(TAATACGACTCACTATAGGG),所设计引物均由上海生工生物工程有限公司合成,各引物序列见表 1。
表1 引物序列Table 1 Primer sequences
1.3 总RNA的提取及cDNA第一链的合成
用RNA提取试剂盒Trizol法提取肝胰腺组织的总RNA,利用NanoDropND1000紫外分光光度计检测RNA浓度和纯度,1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。肝胰腺组织总 RNA用cDNA 反转录试剂盒反转录为cDNA保存于-20 ℃。
1.4 波纹龙虾dsRNA-PhCatC1/2、dsRNA-EGFP模板的制备
制备dsRNA-PhCatC1/PhCatC2/EGFP模板如下:用波纹龙虾肝胰腺cDNA和1.2节设计的引物进行克隆实验。根据TransStartFastPfu Fly DNA Polymerase试剂盒进行,PCR反应体系如下:cDNA 2 μL,引物PhCatC1/PhCatC2-F、PhCatC1/PhCatC2-R各1 μL,5×TransStart FastPfu Fly Buffer 10 μL,TransStartFastPfu Fly DNA Polymerase 1 μL,2.5 mmol·L-1dNTPs 4 μL, 用无核酸酶水补足至50 μL。PCR反应程序如下:95 ℃ 2 min;95 ℃ 20 s,54 ℃ 20 s,72 ℃ 90 s,32个循环;72 ℃ 5 min;于4 ℃保存。PCR产物放于-20 ℃备用,所得产物吸取3 μL用于1.0%琼脂糖凝胶电泳。
普通PCR克隆方法用PCR产物为模板cDNA和1.2节设计的引物进行克隆实验,PCR反应体系如下:cDNA 2 μL,引物PhCatC1/PhCatC2-F、PhCatC1/PhCatC2-R各1 μL,5×TransStart FastPfu Fly Buffer 10 μL,TransStartFastPfu Fly DNA Polymerase 1 μL,2.5 mmol·L-1dNTPs 4 μL, 用无核酸酶水补足至50 μL。PCR反应程序如下:95 ℃ 2 min;95 ℃ 20 s,62 ℃ 20 s,72 ℃ 90 s,32个循环;72 ℃ 5 min;于4 ℃保存。PCR产物放于-20 ℃备用,所得产物吸取3 μL用于1.0%琼脂糖凝胶电泳。
将获得的PCR产物进行切胶回收,根据EsayPure Quick Gel Extraction Kit试剂盒进行。将获得的DNA作为模板,根据T7 High Efficiency Transcription Kit试剂盒说明书进行。PCR反应体系如下:DNA模板 2 μL,5×T7 Transcription Reaction Buffer 4 μL,5×T7 Transcription Enzyme Mix 2 μL,10 mmol·L-1dNTP Mix 8 μL,用无核酸酶水补足至20 μL。将获得的体系充分混合置于PCR仪37 ℃下孵育2 h,加入1 μL DNaseⅠ置于PCR仪37 ℃下孵育15 min,加入1 μL 500 mmol·L-1EDTA(pH值8.0)终止反应。将获得的PCR产物立即进行纯化,根据EasyPure RNA Purification Kit纯化试剂盒进行。
1.5 波纹龙虾PhCatC1/2基因的RNA干扰实验
根据预实验结果确定2 μg·g-1为波纹龙虾最适干扰剂量,从暂养池中调选5组(每组18尾)健康活泼的波纹龙虾在第4步足基部进行注射实验,共分为3个实验组:dsRNA-PhCatC1(2 μg·g-1),dsRNA-PhCatC2(2 μg·g-1),dsRNA-EGFP(2 μg·g-1)。注射后0、24、48、72、96 h取波纹龙虾肝胰腺组织,用RNAlater保存4 ℃过夜后转到-80 ℃冰箱保存,采用qPCR检测干扰结果,配20 μL 反应体系:2×PerfectStartTM Green qPCR SuperMix 10 μL,上、下游引物 (10 μmol·L-1)各1 μL,cDNA 1 μL,ddH2O 7 μL。反应条件为三步法扩增程序:95 ℃ 预变性 300 s;95 ℃ 变性5 s,58 ℃复性15 s,72 ℃延伸10 s,共40个循环。取少量肝胰腺组织进行石蜡组织切片。
1.6 数据分析
qPCR反应以肝胰腺组织的cDNA为模板,使用PerfectStart Green qPCR Super Mix试剂盒对肝胰腺组织进行目的基因(PhCatC1/2、PhTlr13、PhLys和Phβ-G)和内参基因(β-actin)各3个重复的扩增,以内参基因表达量为校对基准,0 h的数据为对照,2-△△CT法计算基因相对表达量。使用Excel 2010软件进行数据处理,使用统计软件SPSS 25.0进行单因素方差 (ANOVA) 分析,显著性水平设为 0.05。
2.1 PhCatC1/2基因的干扰结果分析
在PhCatC1的RNA干扰实验中,PhCatC1-dsRNA对升,但整个胁迫过程均比对照组低,且差异显著(P<0.05),PhCatC1-dsRNA对PhCatC1具有显著的抑制效果。由图1可以看出,PhCatC1的表达量在24 h最低,48～96 h后有所回升;PhCatC2基因的表达量在24～48 h较低,与对照组差异显著(P<0.05),在72 h时逐渐恢复,接近正常值,但在96 h又降低。表明24～96 hPhCatC1/2的dsRNA持续发挥作用,有效地敲降了相应的基因。
柱状图上方“*”代表与对照组的数据相比差异显著(P<0.05)。“*”above the bars represented significant difference(P<0.05)compared with the control group.图1 PhCatC1和PhCatC2基因的RNA干扰实验结果Fig.1 RNA interference test results of PhCatC1 and PhCatC2 gene
2.2 PhCatC1/2基因沉默后对其他免疫基因的表达影响
PhCatC1/2基因对波纹龙虾的RNA干扰抑制结果明显,基于此,研究PhCatC1/2基因继续沉默后对波纹龙虾相关免疫基因的表达分析。
2.2.1PhCatC1基因沉默后对PhCatC2、PhTlr13、PhLys和Phβ-G基因表达影响
沉默PhCatC1基因后对PhCatC2、PhTlr13、PhLys和Phβ-G基因表达有较大影响(图2),结果显示:PhCatC2表达量在24～96 h与对照组显著差异下降(P<0.05),但随着RNAi效应的扩大有短暂的回升;PhTlr13表达量在24 h时比对照显著上升(P<0.05),48～96 h又下降到对照组水平;PhLys和Phβ-G基因的表达量大体随dsRNA干扰时效的增加而增加,在96 h时达到最大值,除24 hPhLys表达量与对照组显著差异下降外,其余时间点PhLys和Phβ-G基因的表达量均比对照组高。
图中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。Different lowercase letters in the figure represented significant difference(P<0.05).The same as below.图2 波纹龙虾PhCatC1基因沉默后不同免疫相关基因的表达变化Fig.2 Expression of different immune-related genes in PhCatC1 silenced Panulirus homarus
2.2.2 沉默PhCatC2基因后对4种免疫基因表达影响
由图3可知,PhCatC1和PhLys基因的表达量在24、48和96 h相对对照组有所下降,而72 h与对照组显著差异上升(P<0.05);PhTlr13和Phβ-G基因的表达量随dsRNA干扰时效的增加而增加,均在72 h达到最大值,而在96 h时有所下降,但均与对照组显著差异上升(P<0.05)。
图3 波纹龙虾PhCatC2基因沉默后不同免疫相关基因的表达变化Fig.3 Expression of different immune-related genes in PhCatC2 silenced Panulirus homarus
2.3 RNA干扰后波纹龙虾肝胰腺组织变化
2.3.1 波纹龙虾实验前肝胰腺组织结构
RNA干扰实验前,挑选健康活泼没有经过处理的波纹龙虾取其肝胰腺组织进行石蜡切片观察其组织情况,如图4可知,其组织结构完整,没有被破坏,箭头所指为正常发育的肝小管结构。
图4 波纹龙虾实验前肝胰腺组织结构Fig.4 Histological structure of hepatopancreas before experiment in Panulirus homarus
2.3.2 RNA干扰后波纹龙虾肝胰腺组织结构
图5为波纹龙虾dsRNA-PhCatC1/2干扰的石蜡切片,结果显示:干扰dsRNA-PhCatC1开始前的24 h波纹龙虾肝胰腺组织细胞结构完整,但个别肝小管细胞变形为椭圆结构,肝小管之间的间隙相比对照组密集但清晰可见;48～72 h肝胰腺组织的细胞结构变椭圆比较明显,有个别出现胀大有破裂的趋势;96 h后肝小管结构涨破清晰可见,几乎看不到有完整的肝小管。
A-D分别表示PhCatC1-dsRNA干扰后波纹龙虾肝胰腺24、48、72和96 h的组织结构;E-H分别表示PhCatC2-dsRNA干扰后波纹龙虾肝胰腺24、48、72和96 h的组织结构。A-D showed the structure of hepatopancreas from 24 to 96 h after PhCatC1-dsRNA interference;E-H showed the structure of hepatopancreas from 24 to 96 h after PhCatC2-dsRNA interference.图5 波纹龙虾PhCatC1/2-dsRNA干扰后的肝胰腺石蜡切片Fig.5 Paraffin sections of the hepatopancreas after interference of PhCatC2-dsRNA in Panulirus homarus
干扰dsRNA-PhCatC2开始前的24 h波纹龙虾肝胰腺肝小管之间的间隙不密集,能看到部分肝小管破裂、变椭圆形和胀大;48 h肝小管之间变得密集,部分肝小管有涨破的趋势,部分肝小管变椭圆形;72 h肝小管椭圆形,间隙密集不清晰,部分肝小管破裂整体看起来杂乱无章;96 h能看到还有局部破裂的结构。综上结果可见,dsRNA-PhCatC1/2干扰后波纹龙虾的肝胰腺组织部分有明显的影响,说明PhCatC1/2基因在波纹龙虾中起着重要作用。
RNA干扰能对物种高度保存的mRNA进行高效特异性降解,是研究基因功能的重要分子工具[1-3]。RNA干扰效果具有剂量、浓度和时间效应性,剂量、浓度和时间不同,基因被沉默的时间和效果也不一样[10]。RNAi在甲壳动物的基因功能研究方面广泛应用,特别是在虾蟹类的免疫、脱壳和生长方面[30-31]。目前虾类主要是通过第4步足的肌节处进行dsRNA注射,该技术已经广泛应用于虾类基因免疫功能研究。
江红霞等[43]实验结果显示,MnCST基因表达在6～14 d这段时间被沉默,14～16 d逐渐恢复正常水平,并且能够同时抑制CtsB和CtsL基因的表达;卜宗元等[44]在注射Ran-dsRNA第7天时对Ran和Vg基因达到最大抑制效果,10～16 d时干扰效果降低,Ran和Vg基因表达量逐渐恢复到正常水平。本实验结果可知,注射PhCatC1-dsRNA后,在24 h达到最佳抑制效果,96 h抑制效果有所降低;而注射PhCatC2-dsRNA后,在24～48 h达到最佳抑制效果,72 h抑制效果最低,与江红霞等[43]和卜宗元等[44]的研究结果相关,上述结果表明,RNA干扰效果会在某个时间段达到最强的作用,然后逐渐变弱甚至消失。
TLR13(Toll like receptor 13)基因是一种 TLR 模式识别受体基因,在水生动物中的研究主要集中在脊椎动物鱼类和软体动物贝类中[41,45]。本研究中发现,当PhCatC1基因沉默后,与对照组相比PhLys基因表达量在前期呈现显著升高,后下降的趋势;而当PhCatC2基因沉默后,PhLys基因表达量一直显著上调。PhLys是水生动物中重要的免疫基因,斜带石斑鱼TLR13基因在副溶血弧菌RNA刺激下表达量显著上调[46],厚壳贻贝在受到溶藻弧菌胁迫时TLR13基因在12 h表达量增加40.27倍[47]。本研究的结果也表明,PhCatC2基因沉默后PhLys基因表达量显著上调,PhCatC1基因沉默后PhLys基因表达量在前期呈现显著升高,结果相似,说明PhCatC1/2基因具有调节TLR13基因的作用,我们推测当PhCatC1/2基因被沉默后,波纹龙虾通过促进TOLL样受体通路来参与免疫应答,从而解释PhCatC1/2基因具有免疫功能,具体还需进一步研究验证。
PhLys是溶菌酶基因,Phβ-G是β-葡萄糖醛酸酶基因,PhLys和Phβ-G均是溶酶体酶基因和抗菌蛋白基因,溶酶体酶基因在一些水生动物鱼类中早有研究报道[49]。本研究中发现,当PhCatC1/2基因沉默后,Phβ-G基因表达量均一直显著上调。而当PhCatC1基因沉默后PhLys基因表达量呈现先下调后显著上调的趋势,当PhCatC2基因沉默后PhLys基因表达量表现出先下调后上调的趋势。罗非鱼在脂多糖刺激后溶酶体酶基因表达量在脾脏和肾脏组织中得到上调[48],日本鳗鲡在爱德华氏菌刺激48 h后溶酶体酶基因表达量在大部分组织/器官中均有上调[49],大鲵在嗜水气单胞菌侵染后肝脏和脾脏中溶酶体酶基因表达量显著上调[50]。本实验结果与以上的相关研究结果相似,说明PhCatC1/2基因被沉默后,波纹龙虾可能通过促进溶酶体通路来参与免疫应答。
本研究中发现,当PhCatC1基因沉默后,PhCatC2基因与对照组相比一直处于显著下降状态,24 h下降到最低值,48～96 h有所回升;当PhCatC2基因被沉默后,PhCatC1基因表达量呈现下上调交替的趋势,在24 h下降到最低值而在96 h上调到最大值。沉默波纹龙虾PhCHH-B基因后Vg基因表达量保持下降趋势,而沉默PhGIH-B基因后Vg基因表达量持续保持上升趋势[33];沉默罗氏沼虾MrTLR1基因后,MrTLR2基因在注射后24 h的表达量显著升高1.36倍而MrTLR3基因无明显变化,有趣的是,沉默MrTLR2和MrTLR3基因后,MrTLR1/3和MrTLR1/2基因无明显变化[51]。这与本研究有点类似,从实验结果可以看出,PhCatC2基因的沉默抑制了PhCatC1基因的表达,而PhCatC1基因的沉默对PhCatC2基因表达的影响并不一样,有些时间点变化趋势一致,这可能跟基因亚型的不同有关,这两个基因在功能上的区别作用还需要进一步研究。
波纹龙虾dsRNA-PhCatC1/2干扰的石蜡切片结果能看出干扰开始前的24 h波纹龙虾肝胰腺组织细胞结构完整,细胞密集清晰可见,能完整看出细胞与细胞之间的间隙和密集程度,以及细胞内各内容物;48～72 h这个时间段肝胰腺组织的细胞结构开始被破坏,从48 h的局部细胞出现裂解现象到72 h的一团糟,可看出RNA干扰效果明显,PhCatC1/2基因是波纹龙虾的重要免疫防御基因;96 h后肝胰腺结构开始恢复,但还有局部细胞被破坏,说明RNA干扰效果随时间的推移而变弱。综上结果可见,dsRNA-PhCatC1/2干扰对波纹龙虾的肝胰腺组织有明显的影响,说明PhCatC1/2基因在波纹龙虾中起着重要作用。
猜你喜欢波纹龙虾对虾对虾养殖弱势群体的管理当代水产(2022年8期)2022-09-20对虾吃料慢的原因分析和处理当代水产(2022年5期)2022-06-05钓龙虾作文大王·低年级(2022年2期)2022-02-28对虾免疫增强剂研究进展当代水产(2021年8期)2021-11-04对虾常见环境性疾病的防治当代水产(2021年4期)2021-07-20基于NACA0030的波纹状翼型气动特性探索北京航空航天大学学报(2021年6期)2021-07-20小波纹的童话阅读(低年级)(2021年10期)2021-03-08龙虾的迁徙小火炬·阅读作文(2019年4期)2019-08-06为什么水面波纹荡漾学与玩(2017年5期)2017-02-16出现得比人类还早的龙虾化石数学大王·低年级(2015年10期)2015-10-21