陶宣伊，戚思薇，朱翔宇，包哲隈，2，杨靖亚，2
（1. 上海海洋大学食品学院，上海 201306；
2. 上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 201306）
烧、烫伤在日常生活中十分常见，存在疼痛、易感染、愈后产生疤痕等问题［1］。一般来说，烧烫伤分为3个级别，Ⅰ度烫伤即红斑性烫伤，Ⅱ度烫伤即水泡性烫伤，Ⅲ度烫伤即焦痂性烫伤，其中Ⅱ度烫伤可分为浅Ⅱ度烫伤和深Ⅱ度烫伤［2］。临床治疗烫烧伤以抗感染、止痛、促进皮肤再生在为主，由于破坏了皮肤表面屏障，其创面易滋生细菌［3］，处理后残留的小创面仍有可能会反复破溃而不愈合，患者皮肤创面抵御微生物入侵能力下降［4］，细菌入侵并大量繁殖而引发化脓感染等会使得治疗更加困难，影响患者康复。
研究显示烧伤病房送检标本中金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）检出率较高，其中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin resistantStaphylococcus aureus，MRSA）占比高［5］，具有多重耐药性。耐药菌产生问题的发生与发展源于抗生素的长期使用［6］，其中烧伤外科在感染防治方面面临巨大挑战［7］，促使治疗效果过早衰退。S.aureus为革兰氏阳性菌，可导致伤口感染和葡萄球菌烫伤皮肤综合征等常见的S.aureus感染性疾病［8］。烧伤创面常用含抗生素药物外敷，研究显示创面S.aureus对青霉素［9］、红霉素［10］耐药性高。通过研究天然产物，从中提取有效抗菌成分作为天然药物来研究抗生素类物质，可缓解新型抗生素研发的压力，为开发新型药物提供可能［11］。
在我国仙人掌属植物药用在《中药大辞典》中早有记载，作为一种中药药材，其具有活血化瘀、清热解毒、止痛消肿的功效［12］。仙人掌的醇提液对铜绿假单胞菌以及变形杆菌等均有抑制作用，且对S.aureus有明显抑制效果［11］，在临床上对由S.aureus引起的感染采用含仙人掌成分的药物治疗，取得了较好的成效。Shimaa 等［12］的试验经HPLC 分析，在仙人掌中观察到8种酚类和黄酮类化合物的存在，酚类主要成分是儿茶素，其次是没食子酸、咖啡酸、绿原酸和酚酸，黄酮类化合物如槲皮素、山柰酚和芦丁。仙人掌提取物具有促进创面愈合作用［13］，可作用于烫伤小鼠。有研究发现，仙人掌在伤口愈合过程的各个阶段，如细胞-细胞、细胞-基质相互作用或胶原合成中检测到有益的皮肤修复活性［14］且临床上仙人掌制品对早期和中期流行性腮腺炎有治疗效果［16］。主要从仙人掌果实和茎中提取的仙人掌多糖（opuntia dillenii polysaccharide，ODP）是其有诸多功效的主要原因之一［17］，而约占仙人掌总质量40%的外皮常作为垃圾处理，但研究显示米邦塔仙人掌表皮及果肉提取物均含有黄酮类成分，且表皮提取物含总黄酮量高于果肉提取物［18］。茶多酚又名茶鞣质或茶单宁，主要包括儿茶素、黄酮、花青素和酚酸等4类化合物［19］。茶多酚能够使得细菌正常形态改变［20］、使细菌细胞出现了不同程度的聚集和穿孔、破坏损伤细胞膜和细胞壁［22］，以及影响菌体基因的正常表达，抑制蛋白质的合成和表达［23］等，从而发挥抑菌效果。茶多酚还可降低创面的炎症反应，加速创伤修复，促进创面表皮再生［24］，能够加速创面修复的天然原材料，并具有具有良好生物安全性。蜂胶有破坏细菌细胞膜的通透性、抑制病原体入侵宿主细胞所需的酶和蛋白质的合成、破坏病原体入侵宿主细胞的能力等［25］，可显著抑制对甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌（MRSA）的繁殖［26］。茶多酚、仙人掌、蜂胶都具有抑菌抗炎活性，产生协同增效作用，能充分发挥天然化合物的优势。
本研究以茶多酚、仙人掌和蜂胶以质量比2∶1∶1［27］制备一种消炎复合物，进行体外抑菌试验测试其抑菌活性，并构建小鼠烫伤模型测试该消炎复合物对于小鼠烫伤创面的治疗作用。
1.1 试验仪器
SYNERGY2 型酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）；
SW-CJ-1F 型单人双面净化工作台（苏州净化设备有限公司）；
85-2 型恒温磁力搅拌器（上海思乐仪器有限公司）；
试验用电磁炉（Midea）
1.2 材料和菌株
仙人掌粉（河南裕英信息技术有限公司，纯度≥95%）；
茶多酚粉（郑州苍宇化工产品有限公司，含量98%）；
蜂胶粉（福建省龙岩市满兜兜商贸有限公司，纯度≥95%）；
大肠杆菌（Escherichia coli，由上海海洋大学微生物实验室提供）；
金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus，由上海海洋大学微生物实验室提供）；
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，由上海海洋大学微生物实验室提供）；
烫伤膏（广舒平）
1.3 试剂和药品
羧甲基纤维素钠800～1 200 mPa·s（国药集团化学试剂有限公司）；
三醋酸甘油酯（上海麦克林生化科技有限公司）；
果胶（上海麦克林生化科技有限公司）；
牛肉膏（上海麦克林生化科技有限公司）；
胰蛋白胨（上海麦克林生化科技有限公司）；
琼脂粉（上海麦克林生化科技有限公司）；
氯化钠（上海展云化工有限公司）；
氢氧化钠（国药集团化学试剂有限公司）；
无水乙醇（上海麦克林生化科技有限公司）；
硫化钠九水合物（上海麦克林生化科技有限公司）；
无水乙醚（俊秀牌）
1.4 试验动物
昆明鼠，体质量23～28 g，性别均为雌性。购于斯贝福（北京）生物技术有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2019-0010
1.5 试验方法
1.5.1 消炎复合物溶液的制备
称取羧甲基纤维素钠（CMC-Na），加入约60°C的蒸馏水中，边搅拌边缓慢加入，配制1%的CMCNa溶液，待溶液溶胀澄清，结块消失后则制作完毕。取茶多酚粉、仙人掌粉、蜂胶粉，质量比为2∶1∶1，依次缓慢倒入100 mL 1% CMC-Na溶液溶解，并不断用磁力搅拌器加热搅拌，分别配制成100、80、40 mg/mL 的溶液，定容后加入果胶和三醋酸甘油酯，混匀，配置完成后过滤除菌。原料用量见表1。
表1 消炎复合物的不同配方Table 1 Different formulas of the anti-inflammatory compound
其中100 mg/mL 浓度的消炎复合物溶液用于体外抑菌试验；
80、40 mg/mL 浓度的消炎复合物溶液分别作为小鼠烫伤试验高浓度组、低浓度组给药浓度。
1.5.2 抑菌试验材料制备与抑菌测定
1.5.2.1 培养基的制备 按培养基配方依次准确称取牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、蒸馏水1 000 mL 加入烧杯中，加热至完全溶解后加入琼脂粉，继续加热使琼脂溶解不断搅拌。材料溶解后将pH调至7.3～7.6，分装至试管内或三角烧瓶内（每个锥形瓶倒入100～150 mL 培养基，使灭菌完全），在103.43 kPa，121 ℃下高压灭菌20 min。灭菌后趁热倒平板和斜面，将6支装有培养基的试管倾斜放置，制成斜面。剩余培养基倒成平板，备用。
1.5.2.2 菌悬液的制备 采用平板计数法［28］计算菌落个数，取每个浓度梯度的菌悬液200 μL 转移至平板上，涂布均匀，每种菌每个浓度重复3次，倒置于37 ℃恒温培养箱中培养48 h。
菌液浓度（CFU/mL）=［3 个平板的总菌落数/3］×5×稀释倍数
将每种菌种挑取4环，稀释梯度，根据已经绘制的菌数-吸光值标准曲线制备相应浓度的菌悬液，分别用接种环从斜面上挑取1环至10 mL生理盐水中，得到3种菌的菌悬液母液。测得金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌3 种菌悬液的母液吸光值为0.361、0.340、0.341，经过稀释法稀释菌液后得到吸光值为0.051、0.052、0.052 的菌悬液，约为标准曲线中的浓度为1×106的菌悬液。本试验中所需供试液浓度为106CFU/mL。
1.5.2.3 抑菌作用的测定 1） 滤纸片扩散法 本试验采用滤纸片扩散法［28］检测消炎复合物的抑菌活性。制备若干直径6 mm的圆形滤纸片，高温灭菌备用。将滤纸片完全浸没在消炎复合物液体中，静置5 min。将1个培养单种菌种的培养基分为4个区，中间1 个对照组，其它3 个为相同浓度的药物组，相当于每种细菌的同种药物浓度平行做3组试验，结果取均数±标准差（-x±s，cm）。使用移液枪转移200 μL菌液至培养皿中，涂布均匀，放置1 min 后贴上吸收消炎复合物液体的滤纸片，用浸入75%乙醇的滤纸片为对照，放置在培养基中央。细菌置于37 ℃的培养箱中培养24 h后查看抑菌圈情况。
2） 最小抑菌浓度（MIC）的测定 将“2.1”项下制备好的100 mg/mL 溶液用二倍稀释法［30］制备浓度分别为1、5、10、20、40、80、100 mg/mL的消炎复合物溶液，分别浸入直径为6 mm 的圆形已灭菌的滤纸片。按照滤纸片扩散法进行最小抑菌浓度的测定，将细菌置于37 ℃培养箱培养24 h 后测量抑菌圈直径。每种供试菌、每个浓度的复合物溶液重复3次试验，取平均值。规定最小抑菌浓度为首次出现抑菌圈的最小浓度。
1.5.3 小鼠烫伤试验
1.5.3.1 小鼠烫伤模型的建立 于建模前1 d用电动剃毛器将小鼠背部毛发剪短，使用8%硫化钠溶液［31］作为脱毛剂。建模时把小鼠与浸入乙醚的棉球投入玻璃缸中，待小鼠停止活动即为轻度麻醉。将小鼠转移至工作台上，胶带固定颈部以防烫伤过程中小鼠苏醒挣扎。使用加热的砝码［32］作为烫伤物，将2个10 g砝码放入锅内与热水同时加热，待水沸腾后维持10 min，用镊子把砝码夹出，迅速放置于小鼠背部皮肤上并轻微施加压力，持续10 s即可建立浅Ⅱ度烫伤模型。
1.5.3.2 分组和给药 建立小鼠烫伤模型后观察48h，待伤口稳定后给药，选取12只伤口大小相近的小鼠，分为高浓度组（80 mg/mL）、低浓度组（40 mg/mL）、烫伤膏组（阳性对照）和生理盐水组，每组3只，每组饲养于同一鼠笼。高浓度组、低浓度组和烫伤膏组小鼠每次换药前用生理盐水棉球清洗伤口并擦干，再用棉签蘸取相应药物在小鼠背部创面上涂抹均匀，作用1 min 后盖上一层纱布，对应给药剂量为0.2 g/个伤口；
生理盐水组用生理盐水浸湿棉球，涂抹于小鼠创面。每组小鼠每天给药2次，早晚各1次，持续10 d，期间自由饮食。
1.5.3.3 促烫伤创面愈合功能检测 于给药后第1、4、7、10天记录创面面积。在小鼠旁放置尺子作为比例尺，拍照，将照片导入Photoshop 计算创面面积［33］，记录后计算创面愈合率。
创面愈合率（%）=（原始创面面积－未愈合创面面积）/原始创面面积×100%
1.5.3.4 脏器系数测定 脏器系数即试验动物某脏器的质量与体质量的比值，是毒理试验中常用的指标，在本试验中用于检验消炎复合物对小鼠有无毒性。于给药后第10天记录创面面积后称量每只小鼠，完成后进行处死并解剖。取小鼠心、肺、肝、脾、肺、肾脏，分别称质量。
脏器系数（%）=（某脏器质量/小鼠体质量）×100%［34］
1.6 数据分析
将创面愈合率和脏器系数数据导入SPSS statistics 21.0 进行分析，结果以-x±s表示，进行组间显著性分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。
2.1 不同浓度的消炎复合物对3 种细菌的抑菌作用
试验过程中消炎复合物以及75%酒精对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径见表2。
表2 消炎复合物及75%酒精对各供试菌株的抑菌圈直径Table 2 Diameter of bacteriostatic circle of the anti-inflammatory compound and 75% alcohol on all tested strains
从表2的数据中可以分析出，消炎复合物对3种供试菌的抑菌效果皆存在量效关系，即消炎复合物浓度越大，抑菌圈直径越大，抑菌效果越强。因此，消炎复合物对3种菌的抑菌效果强弱为：金黄色葡萄球菌＞大肠杆菌＞枯草芽孢杆菌。
2.2 消炎复合物对3 种细菌的最小抑菌浓度（MIC）测定结果
试验得出了其对3种细菌的最小抑菌浓度见表3。对于大肠杆菌和枯草芽孢杆菌，二者都在消炎复合物浓度为40mg/mL时首次出现抑菌圈，而对于金黄色葡萄球菌，消炎复合物浓度为10 mg/mL时出现抑菌圈。因此，该消炎复合物对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的MIC为40 mg/mL，对金黄色葡萄球菌的MIC为10 mg/mL。
表3 消炎复合物对3种细菌的最小抑菌浓度Table 3 Minimum inhibitory concentration of the antiinflammatory compound on three kinds of bacteria
2.3 小鼠创面变化观察
2.3.1 小鼠烫伤创面变化 砝码接触小鼠背部皮肤后，烫伤处皮肤立即变白。烫伤后近似白色的圆形，与周围皮肤有明显的区别。各组小鼠烫伤创面变化如图1，分别为生理盐水组、低浓度组、高浓度组以及烫伤膏组在1 d 时和给药10 d 时得烫伤创面变化。图中可看出烫伤后24 h，烫伤处伤口全部溃破，伤口颜色呈较深的粉红色，伤口平坦，与周遭皮肤并无高低差异。在给药10 d 时，各小鼠痂皮大面积缩小，基本脱落，其中高浓度组创面变化最大，治疗效果最好。
图1 小鼠烫伤创面Figure 1 Changes of scalded wound of mice
2.3.2 小鼠各组创面愈合率比较 试验过程中各组创面愈合率数据经统计学处理后的结果见表4。各组创面愈合率比较见图2。创面愈合标准：正常皮肤和创面边界出现深粉红色肉芽，表面光滑，与暗红色的创面有显著区别，即可认为已经愈合。从表4、图2的数据中可以分析出，各组小鼠的创面恢复情况随着给药天数的增加而好转，创面愈合率持续上升。
图2 小鼠创面愈合率Figure 2 Comparison diagram of wound healing rate in mice
表4 各组小鼠创面愈合率比较Table 4 Comparison of wound healing rate of mice in each group±s，%
表4 各组小鼠创面愈合率比较Table 4 Comparison of wound healing rate of mice in each group±s，%
与生理盐水组相比，*P＜0.05表示有显著性区别。Compared with the normal saline group， * P＜0.05 indicates a significant difference.
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2.4 小鼠行为观察
烫伤前各组小鼠行为活跃，经常出现倒悬于笼盖上的活动，烫伤后该行为消失，小鼠活动减少，睡眠时间变多。给药3～7 d 期间，随小鼠烫伤创面情况转好，小鼠该行为又重新出现，并且小鼠出现偏好钻入垫料中的行为，推测出现这一现象的原因系脱毛、毛发减少导致的体温维持性能下降。
本试验给药时采用棉签或棉球涂抹创面的方式，在给药过程中棉签或棉球将与创面发生摩擦，使小鼠疼痛而产生不同程度的挣扎，生理盐水组的小鼠挣扎幅度最大，有后缩的现象，因此推测该组小鼠创面疼痛程度最大。且在经过1周的给药后，其余组的小鼠在给药时较为安定，而生理盐水组小鼠反应仍较为强烈。初步推定，在给药治疗小鼠促进烫伤创面恢复的过程中，消炎复合物以及烫伤膏给药后创面恢复程度较生理盐水组高，给药后疼痛程度降低，使小鼠行为安定。
2.5 消炎复合物对小鼠内脏的影响
2.5.1 脏器系数测定结果 各组小鼠各主要脏器的脏器系数见表5。分析表5 可知消炎复合物组各脏器系数与生理盐水组没有显著性区别，初步判断其对小鼠主要脏器无毒性作用。
表5 各组小鼠的脏器系数比较Table 5 Comparison of organ coefficients of mice in each group±s，%
与生理盐水组相比，*P＜0.05表示有显著性区别。Compared with the normal saline group， * P＜0.05 indicates a significant difference.
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2.5.2 大体解剖结果 小鼠经大体解剖后取出心、肝、脾、肺、肾脏，进行肉眼观察，见图3。观察各小鼠的主要脏器，与正常小鼠的脏器比较，并无明显差异。
图3 小鼠大体解剖Figure 3 Gross anatomy of mice
本试验配置了4种仙人掌消炎复合物液体：（1）300 mg/mL：该组溶液过于浓稠，粉末状溶质相较于溶剂过多，粉末无法均匀分布在溶液中，且流动速度极慢，无法倒入容量瓶内准确配制；
（2） 200 mg/mL：该浓度溶液较（1）略微改善了问题，但是与（1）相同，粉末无法均匀分布在溶液中，流动速度极慢，无法倒入容量瓶内准确配制；
（3） 100 mg/mL：该浓度溶液流动性适中，3种粉末可以均匀分布在溶液内部，易倒入容量瓶进行定容等操作，加入果胶后复合物状态呈粘稠状，粘度适中，质地均匀；
（4） 100 mg/mL：该组溶液与（3）相比虽然3种粉末可以均匀分布在溶液内部，易倒入容量瓶进行定容等操作，但流动性较差，加入果胶后复合物状态过于黏稠，2%CMC-Na溶液与果胶交联性过强，无法混合均匀，质地粗糙。通过外观判断并综合了4种溶液的黏稠度和性状之后决定了本次试验中所使用的仙人掌消炎复合物溶液均由表1中100 mg/mL配方制成。
体外抑菌试验研究验证，对照组的75%乙醇对以上3种细菌的抑菌圈大小均为0.8 cm左右，所以消炎复合物在最小抑菌浓度下的抑菌活性较好，相当于75%乙醇的抑菌活性程度。从张文［11］等的试验中可以得出，仙人掌的水煎液（148 mg/mL）与醇提取液（387 mg/mL）对金黄色葡萄球菌的MIC分别为74 mg/mL 和12 mg/mL。郗慧芝［35］等的试验中，100 mg/mL浓度的仙人掌水煎液与醇提液对于金黄色葡萄球菌的MIC分别为88 mg/mL和59 mg/mL。对比本试验中消炎复合物溶液（100 mg/mL）对金黄色葡萄球菌的MIC为10 mg/mL，可初步认为，对于金黄色葡萄球菌的抑制能力由大到小排序为：消炎复合物＞仙人掌醇提取液＞仙人掌水煎液。
小鼠烫伤试验中与生理盐水组小鼠相较而言，高浓度、低浓度消炎复合物组和烫伤膏组在给药的前4 d 并无显著性差异，而随着时间推移高浓度组、低浓度组和烫伤膏组在第7、10天时创面愈合率明显高于生理盐水组，均具有显著性差异（P＜0.05）。第7、10天时，高、低浓度消炎复合物组的创面愈合率均值与烫伤膏组相近，这表明该消炎复合物具有与烫伤膏相当的治疗烫伤创面的作用，然而第10天前高浓度组和低浓度组相较于烫伤膏组数据来说标准差略大，这意味着此消炎复合物对小鼠烫伤创面的治疗作用可能不如烫伤膏稳定。因此，为了评价此消炎复合物长期使用的安全性及稳定性，我们进行了小鼠的大体解剖并计算其脏器系数。脏器系数常在动物毒理学实验中作为一种生理指标，脏器重量发生的变化反应化学物质的毒性大小和效应［36］。本试验用高、低浓度消炎复合物对小鼠进行给药，试验过程中未见小鼠死亡，其饮水、进食、活动、步态等均基本正常，鼻、眼无异常分泌物，未见呼吸困难等异常改变，未见呕吐、腹泻等胃肠道反应。于给药后第10天记录创面面积后称量每只小鼠，完成后进行处死并解剖，取小鼠心、肺、肝、脾、肺、肾脏，分别称质量，计算小鼠脏器系数，由试验结果已知，消炎复合物较生理盐水对照组没有显著性区别，可认为其无明显毒性。
在邵杰等的试验中，磺胺嘧啶银（AgSD）具有体外抑菌以及烫伤创面愈合的双重作用［37］，为减少菌种抗生素耐药性提供新的方法与材料，与本试验目的一致。其试验中粗粉AgSD的MIC=16 mg/mL，纳米AgSD 的MIC=8 mg/mL，在未涂菌的纳米AgSD凝胶组小鼠的深Ⅱ度烫伤创口愈合率在第2周达到最佳。对比本试验，消炎复合物对金黄色葡萄球菌的MIC=10 mg/mL，抑菌能力有待提高，可进一步研究复方的组分，提高抑菌能力，进而达到提高创面治疗抗感染的能力。本试验低浓度组（40 mg/mL）、高浓度组（80 mg/mL）均给药0.2 g/d/只，在第10 天，创面愈合率就达到（96.25±3.89）%和（94.60±5.72）%，可见消炎复合物对于烫伤创面愈合能力强，用药量较少，且无不良反应，可初步认为消炎复合物能在烫伤治疗中增强患者顺应性，减少长期用药带来对身体的损伤。该消炎复合物提供了在烫伤创面受耐药性金色葡萄球菌感染恢复的非抗生素药物治疗可能性，实现抗感染与创面愈合的双重作用，且对于茶多酚组合仙人掌医用产品的开发提供了科学的依据和资料。本研究中仙人掌具有低的抗药性和提取成本，因不同仙人掌以及同种仙人掌的不同部位的物质活性差异［17-18］和使用的提取方法不同，可影响其药物利用度和治疗效率，若从中选择最优仙人掌品种并挑取其抗炎物质活性最高的部位，使用样品利用率高的提取方法来提取复合物的原料，可提高消炎复合物的抗菌以及烫伤创口治愈效果。
综上，本试验使用100 mL 1%的CMC-Na溶液与茶多酚粉、仙人掌粉、蜂胶粉（质量比为2∶1∶1）制成的消炎复合物进行了体外抑菌试验，表明其对金黄色葡萄球菌有明显抑制作用，MIC为10 mg/L；
并进行了小鼠烫伤试验，其中高浓度组创面愈合能力强，治疗效果与烫伤膏相当，但稳定性不如烫伤膏。小鼠行为观察、脏器系数的测定以及大体解剖的结果可初步表明，该消炎复合物无明显毒副作用，具有一定安全性。对于易被金黄色葡萄球菌感染的烫伤创面，本次研究制成的消炎复合物中含仙人掌多糖、黄酮类化合物、茶多酚、蜂胶等抗菌消炎物质，初步验证了其配合使用适量可宏观上加速伤口愈合，证明其具有一定促进伤口愈合作用和抗菌的双重作用，且用药量较少，可提高患者顺应性，为临床治疗烫伤而引起的创面感染耐药菌治疗提供新的可能性。