刘芹，孔维丽，崔筱，牛森园，师子文，吴杰，梁雪迪，刘阳
摘 要：为揭示糙皮侧耳原基发育的潜在调控物质，采用代谢组学的方法对糙皮侧耳菌丝体和原基细胞代谢物进行检测分析。结果表明，菌丝体与原基细胞的代谢物具有显著差异。采用正交偏最小二乘判别分析（OPLS‐DA），以VIP（varible importance in the projection）≥1和倍数变化≥ 2或≤ 0.5为条件共筛选到400种差异代谢物。调控通路分析表明，这些差异物质涉及33条代谢通路，其中丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸、氨酰tRNA生物合成、嘌呤代谢等8条代谢通路具有极显著影响。谷氨酸和谷氨酰胺涉及p < 0.01的大部分代谢通路，可能在糙皮侧耳原基发育过程中具有重要调控作用。研究结果为糙皮侧耳以及其他大型真菌原基发育机制的探索提供了理论依据。
关键词：糙皮侧耳；
原基发育；
代谢组学；
差异代谢物；
代谢通路
中图分类号：
S646.1+41 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2024）06-052-09
Analysis of associated substances and metabolic pathways involved in primordium development of Pleurotus ostreatus
LIU Qin1， KONG Weili1， CUI Xiao1， NIU Senyuan2， SHI Ziwen3， WU Jie3， LIANG Xuedi3， LIU Yang2
（1. Institute of Edible Fungi， Henan Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Evaluation and Utilization of Edible Fungi Germplasm Resources in Huang-Huai-Hai Region， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Zhengzhou 450002， Henan， China; 2. College of Life Science and Technology， Henan Institute of Science and Technology， Xinxiang 453003， Henan， China; 3. College of Life Sciences， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， Henan， China）
Abstract：
In order to reveal the potential regulatory substances involved in primordium development of Pleurotus ostreatus， the metabolomics was used to detected the cellular metabolites in mycelium and primordium. The results showed that there were significant differences between the cellular metabolites in mycelium and primordium. A total of 400 differential metabolites were screened under the condition of VIP（varible importance in the projection）≥1 and fold change≥2 or ≤0.5 using orthogonal partial least squares discriminant analysis （OPLS-DA）. According to pathway analysis， these differential substances might involve 33 metabolic pathways， among which 8 metabolic pathways， including alanine， aspartate and glutamate， aminoacyl tRNA biosynthesis and purine metabolism， had extremely significant effects. Glutamate and glutamine involved in most of the metabolic pathways with p< 0.01， therefore they might play an important regulatory role in primordium development of P. ostreatus. This study provides a theoretical basis for exploring the development mechanism of P. ostreatus and other macrofungus.
Key words：
Pleurotus ostreatus; Primordium development; Metabolomics; Differential metabolite; Metabolic pathways
大型真菌因其独特的香气、风味、质地和药用特性而广受消费者喜爱[1]。目前，世界上可食用的大型真菌有近2000种，因为称之为食用菌，其中有不少于35种已经实现在全球范围内大规模种植[2]。糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus）是世界上最广泛种植和消费的食用菌之一，具有栽培技术简单、栽培原料来源广泛的优点[3]。糙皮侧耳可将农业废弃物转化为高营养价值的食品，能有效提高种植者的收益[4]。此外，糙皮侧耳含有大量的多糖（β-葡聚糖）、膳食纤维、不饱和脂肪酸、多肽、糖蛋白和抗氧化化合物，也是钠、钾、钙、镁、磷等矿物质和维生素的重要来源[5]。研究表明，糙皮侧耳还具有显著的抗病毒、抗菌、抗氧化、抗炎及免疫调节等活性，深受消费者青睐[6-8]。
糙皮侧耳的生长发育一般分为两个阶段：第一阶段为营养生长阶段，从接种直至菌丝生理成熟；
第二阶段为生殖生长阶段，即子实体发生和发育阶段，从原基形成到子实体成熟[9]。食用菌原基发生是子实体形成和产量效益的前提和基础，目前对食用菌的研究主要集中在营养生理、风味物质以及功能物质方面，对原基发生和发育的研究非常有限[9-11]。陈鹏至等[12]研究表明，富马酸、琥珀酸、6-磷酸葡萄糖酸、甜菜碱等13种仅在原基中检测到的小分子物质可能对亚洲兰茂牛肝菌（Lanmaoa asiatica）原基的发育具有至关重要的作用。杨晓敏等[13]采用核磁共振、气相质谱和液相质谱3种检测技术对亚洲兰茂牛肝菌的菌丝体及原基的小分子物质进行比较分析，推测谷氨酸在原基发育中起着重要的调控作用。李玉等[14]研究表明，茉莉酸甲酯可促进金针菇原基的形成。
代谢组学是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后迅速发展起来的一门新学科[15]，旨在检测特定条件下有机体或细胞内内源性代谢物的整体轨迹，以反映生物体的病理或生理过程，而检测到的一些差异代谢物已成为表征生物体病理或生理状态的潜在标记物[16]。代谢组学已广泛应用于疾病诊断、药物开发、微生物代谢、动植物代谢等多个领域[17-19]。近年来，代谢组学技术逐渐应用于食用菌领域，研究食用菌在特定环境条件下的代谢机制。Zhao等[20]基于GC–MS非靶向和靶向代谢组分析鉴定了高温胁迫下香菇菌丝代谢组的变化
2.4 差异代谢物筛选
采取将Fold change、OPLS-DA模型的VIP值相结合的方法来筛选具有差异性表达的代谢物，筛选标准为VIP ≥ 1和Fold change ≥2 或≤ 0.05。共筛选出400种差异代谢物，差异代谢物占总代谢物的74.91%，说明菌丝体组和原基组代谢物质差异显著。其中氨基酸及其衍生物80种、酚酸类33种、核苷酸及其衍生物46种、木脂素和香豆素3种、其他类46种、鞣质1种、生物碱43种、有机酸63种和脂质85种（图5-a）。原基组和菌丝体组相比，显著上调的代谢物有310种，显著下调的有90种（图5-b）。对筛选到的差异代谢物的差异倍数进行log2处理，变化最显著的20种（上调和下调）差异代谢物见图5-c。与M组相比，P组中的4-乙酰氨基丁酸、葡萄糖-1-磷酸、9-（阿拉伯糖基）次黄嘌呤、2-脱氧核糖-1-磷酸、L-苏氨酸、L-高丝氨酸、L-丝氨酸、环亮氨酸、L-天冬酰胺和溶血磷脂酰胆碱18∶3（2n异构）等物质含量显著增加。而15（R）-羟基亚油酸、1-甲基胍、2-氧代己二酸、丁香醛；
4-羟基-3，5-二甲氧基苯甲醛、3-异戊烯基-4-O-葡萄糖氧基-4-羟基苯甲酸、水杨酸、松柏苷、7，8-二羟基-9，12-十八碳二烯酸、9-氨基吡啶并（1，2-a）吲哚6，10-二酮和鸟苷 3"，5"-环单磷酸等物质含量显著降低。
2.5 差异代谢物调控通路及富集分析
基于影响值大于0对关键代谢途径进行筛选，结果如图6所示，共得到33条关键代谢通路，其中影响值大于0.3的通路有13条，分别为丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，半胱氨酸和蛋氨酸代谢，半乳糖代谢，嘧啶代谢，丁酸代谢，精氨酸生物合成，淀粉和蔗糖代谢，三羧酸循环，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，嘌呤代谢，精氨酸和脯氨酸代谢，赖氨酸生物合成，烟酸和烟酰胺代谢。
对p< 0.01的代谢通路进行分析并绘制气泡图（图7），共显示8条代谢通路，分别为丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，氨酰tRNA生物合成，嘌呤代谢，赖氨酸生物合成，三羧酸循环，乙醛酸盐和二羧酸盐代谢，精氨酸和脯氨酸代谢，以及精氨酸生物合成。利用KEGG等权威物质数据库映射，得到通路所涉及的差异物质有54个。具有显著差异的8条代谢通路和54个物质的富集关系见图8，所涉及的代谢通路主要为氨基酸调控通路，其中谷氨酸、谷氨酰胺参与了大部分通路，说明两者在连接各通路上具有重要作用（图9）。
3 讨论与结论
笔者利用非靶向代谢组学技术对糙皮侧耳菌丝体和原基的细胞代谢产物的差异进行分析，共检测出534种物质，通过PCA和OPLS‐DA图可以看出菌丝体和原基样品之间的代谢物具有明显差异。以VIP ≥ 1和倍数变化≥2 或≤ 0.05为条件进行筛选，两组间的差异代谢物共有400种，其中含量上调的差异代谢物有310种，含量下调的差异代谢物有90种，这些差异代谢物，尤其是极显著上调、下调物质如4-乙酰氨基丁酸、葡萄糖-1-磷酸、9-（阿拉伯糖基）次黄嘌呤、9-氨基吡啶并（1，2-a）吲哚6，10-二酮和鸟苷3"，5"-环单磷酸等可能对原基发育起潜在的调控作用。
对差异代谢物进行代谢通路分析，影响值大于0的代谢通路有33条，其中影响最大的有8条，分别为丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，氨酰tRNA生物合成，嘌呤代谢，赖氨酸生物合成，三羧酸（TCA）循环，乙醛酸盐和二羧酸盐代谢，精氨酸和脯氨酸代谢以及精氨酸生物合成。在所有代谢通路中丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢影响值最大，其中谷氨酸和谷氨酰胺参与了大部分通路，说明这些物质可能对糙皮侧耳原基发育具有重要的调控作用。该研究结果与杨晓敏等[13]的研究结果一致，谷氨酸是连接各氨基酸通路的关键物质，可促进兰茂牛肝菌原基的萌发与生长。谷氨酸在生物生长、发育以及响应和适应环境胁迫中具有重要作用[25]。谷氨酸、谷氨酰胺和草酰乙酸之间的转化可以将其代谢与TCA循环、碳代谢以及能量合成联系在一起[13]。在丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径中，谷氨酸和谷氨酰胺可以通过天冬氨酸转化为草酰乙酸，也可以通过丙氨酸、丙酮酸转化为草酰乙酸，作为碳骨架的来源进入TCA循环。TCA循环是生物体内连接糖、氨基酸和脂类物质最重要的核心代谢途径之一，谷氨酸和谷氨酰胺可以通过TCA循环为原基生长发育提供所需的能量和营养物质[26]。谷氨酸和谷氨酰胺还可作为生物体内氨基酸以及其他含氮物质生物合成的重要N供体。谷氨酸的碳骨架和α-氨基是γ-氨基丁酸、精氨酸和脯氨酸的合成基础[27]。谷氨酸通过精氨酸生物合成途径生成鸟氨酸、瓜氨酸以及精氨酸；
精氨酸又可分解为尿素和鸟氨酸，鸟氨酸经腐胺又生成谷氨酸，完成氮代谢，为原基的生长发育提供氮源。谷氨酸和谷氨酰胺可以通过谷氨酸激酶，生成谷氨酸半醛，进而生成脯氨酸。脯氨酸积累可稳定大分子化合物，在生物体组织分化和发育中发挥作用。谷氨酸和谷氨酰胺是细胞转氨化反应的主要氨基酸供体[28]。此外，谷氨酸还在微生物脂质合成调控中起重要作用[29]。谷氨酸还是四吡咯、谷胱甘肽和叶酸等物质合成的前提和基础[13]。因此，谷氨酸及谷氨酰胺对糙皮侧耳原基发育的调控作用及其机制值得关注及深入研究。
综上所述，笔者采用代谢组学方法分析了糙皮侧耳菌丝体及原基中细胞代谢产物的差异，推测谷氨酸和谷氨酰胺可能对糙皮侧耳原基发育具有重要的调控作用。下一步可在培养基中添加不同浓度的谷氨酸/谷氨酰胺以及相关抑制剂对其功能和作用机制进行深入研究。
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