柴荣耀,游雨欣,,邱海萍,郭峻宁,张 震,李 斌,沈升法,王艳丽,*
(1.浙江省农业科学院 植物保护与微生物研究所/省部共建农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室/浙江省国家农作物品种抗性鉴定试验站,浙江 杭州 310021; 2.浙江大学 生物技术研究所,水稻生物育种全国重点实验室/农业农村部作物病虫分子生物学重点实验室/浙江省作物病虫生物学重点实验室,浙江 杭州 310058; 3.浙江省农业科学院 作物与核技术利用研究所,浙江 杭州 310021)
甘薯[Ipomoeabatatas(L.) Lam.]是我国第四大粮食作物[1],具有营养价值高、生长适应性广、生产期长等特点。然而,由达旦提狄克氏菌Dickeyadadantii侵染引起的甘薯茎腐病是严重为害甘薯的一种细菌性病害[2],在浙江、河北、河南等省份发生较为严重[3],现已被列入浙江省植物检疫性有害生物补充检疫对象名录[4]。该病原菌寄主范围广,致病力强,主要为害薯苗、茎蔓、叶片和薯块等部位,对甘薯生产造成毁灭性的影响,至今仍缺乏系统有效的防治措施[5]。因此,寻找具有抗茎腐病的甘薯新品种十分必要。
选育和种植甘薯茎腐病抗病品种是针对甘薯茎腐病最为经济有效环保的防治方法,也是控制病害的最根本措施之一。在抗病品种的选育过程中,需要进行大量的抗病性鉴定试验,因此,建立完善的病害抗性鉴定评价方法是重要前提。操作简单、快速准确的接种鉴定方法是研究中不可或缺的。目前,植物病原细菌的接种方法较多[6-7][8],如剪叶法、浸(蘸)根法、针刺法、喷雾法、摩擦法、注射法和灌注土壤法等。这些方法因细菌病害和寄主不同,作用效果也不同。在甘薯茎腐病的研究中,以往用的针刺法[9]和薯块切片接菌法[10]以及已报道的剪叶法、喷雾法等常用的细菌病害接种方法[11],都存在一些弊端,如得到的致病甘薯的发病症状不稳定,接菌量很难保证一致,不适用于甘薯茎腐病的大规模接种抗性鉴定[12]等。因此,建立一种操作简单、快速准确、效果稳定的抗性鉴定方法对于甘薯的种质资源和育种材料的筛选以及品种抗性评价至关重要。
本文旨在建立和优化甘薯茎腐病的抗性鉴定技术,选取最佳接种方式和接种菌液浓度建立甘薯抗茎腐病鉴定标准,通过对6个代表性种质进行室内接种与田间抗性比对验证,用于室内接种抗性精准鉴定;对65份甘薯种质进行室内接种抗性鉴定,明确这些种质的真实抗性水平,并选育和种植对甘薯茎腐病表现出稳定抗性的品种来防治该病害,为种植抗茎腐病、综合性状好的甘薯和生产提供技术支持,为甘薯抗茎腐病育种和品种的抗性改良提供可利用的抗性资源。
1.1 材料
供试甘薯种质资源共65份,均由浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所薯类育种与栽培研究室提供。
供试菌株为达旦提狄克氏菌 (Dickeyadadantii) dd1、dd2,由浙江省农业科学院植物保护和微生物所分离、鉴定和保存。
接种菌液制备:活化保存的甘薯茎腐病菌,挑取单菌落在NA培养基上划线,置于28 ℃培养箱中培养48 h。挑取单菌落于LB液体培养基中,在摇床中以28 ℃,200 r·min-1培养24～36 h。用无菌水配成浓度为4.4×108CFU·mL-1的菌悬液作为接种菌液。
1.2 甘薯茎腐病接种方法
根据田间甘薯茎腐病发病特点和品种抗性鉴定研究工作所需要求,设计了薯苗不同扦插栽培方式、病菌不同接种方式等多种病害接种方法进行接种鉴定技术研究。
1.2.1 盆栽土壤扦插接菌法
在张鸿等[13]的基础上进行改进。用口径20 cm的育苗盆装适量无菌潮湿沙壤土,用无菌手术刀将甘薯苗主茎或侧枝修剪成带有3～4片展叶的茎枝进行扦插移栽,并在薯苗基部浇灌2 mL接种菌液,以等量无菌水作为对照。接种后逐天观察甘薯苗发病情况,并对各处理组进行发病结果调查统计。每个盆栽接种3株甘薯苗,3盆为一组,设3次重复。
1.2.2 水泥槽蛭石拌菌移栽法
在水泥槽中铺满无菌略潮湿的蛭石,将接种菌液拌入蛭石中,使其湿润。接着扦插新生的3～4片真叶的甘薯苗,每区栽插10株甘薯苗为一组,共设3组重复。以无菌水蛭石作为对照组。接种后逐天观察甘薯苗发病情况,并对甘薯苗进行病害等级鉴定。
1.2.3 试管菌液插苗法
在张希太等[14]的基础上进行改进。甘薯苗直接插入装有5 mL接种菌液的试管中培养,置于可控温控光的培养室内,温度为30 ℃,空气相对湿度为80%。以装有无菌水的大试管为对照。10株甘薯苗为一组,设3次重复。逐天观察并统计甘薯苗在试管中的发病情况。
1.2.4 组培瓶蛭石菌液浸苗扦插法
参照刘伟明等[15]的接种方法,并在此基础上加以改进。将带有3～4片展叶的薯苗基部轻轻置于菌悬液(菌液浓度为4.4×108CFU·mL-1)中浸泡2 min。在组培瓶中装满无菌水,使蛭石充分湿润,将处理过的薯苗扦插于蛭石中,置于可控温控光培养室内培养,温度为30 ℃,空气相对湿度为80%;以浸泡无菌水的薯苗为对照。每个组培瓶中培养1株,9株为一组,每组重复3次。在接种后逐日记录甘薯苗的发病情况。
1.2.5 组培瓶蛭石扦插灌根法
在谢越盛等[16]的基础上,加以改进。在组培瓶中装满无菌水,使蛭石充分湿润,扦插带有3～4片展叶的薯苗于蛭石中,在薯苗基部浇灌1 mL的接种菌液。以浇灌无菌水为对照。置于温度为30 ℃,湿度为80%的可控温控光培养室内,逐天调查发病情况。每个组培瓶中培养1株,9株为一组,每组重复3次。
1.2.6 组培瓶蛭石薯苗针刺法
在柴一秋等[17]方法的基础上进行改进。在装有无菌水的组培瓶中填充蛭石并充分湿润。选取带有3～4片展叶的健康薯苗,将其茎基部用无菌针头刺伤,取1 mL配制好的接种菌液滴加在针刺伤口处(伤口全部在空气中),以滴加无菌水为对照。之后用灭菌湿棉球包扎伤口,放入装满蛭石的组培瓶中,置于培养室内培养(温度为30 ℃,湿度为80%)。每个组培瓶中培养1株,9株为一组,每组重复3次。
1.2.7 组培瓶蛭石薯苗擦伤接菌法
在无菌条件下,将带有3～4片展叶的薯苗用600目砂纸在距下端剪口5 cm茎基处轻擦出0.5～1 cm的伤口,并扦插到蛭石中,使得伤口处一部分没入蛭石,另一部分暴露在空气中,用移液枪滴加1 mL接种菌液于甘薯苗擦伤处,置于可控温控光培养室内培养(温度为30 ℃,湿度为80%)。以滴加无菌水为对照。每个组培瓶中培养1株,9株为一组,每组重复3次。
1.3 甘薯茎腐病菌接种菌液浓度
在作物细菌病害接种中,病菌接种菌液浓度会影响作物发病情况,因此,在作物抗病性鉴定中需明确最佳接种菌液浓度。本文上述不同接种方法的对比试验中,所采用的甘薯茎腐病菌接种菌液浓度均为4.4×108CFU·mL-1(D600=0.2)。前人研究表明,在选取了已明确田间抗病性表现为抗病、中感、感病的3个甘薯品种,用浓度为4.4×108CFU·mL-1的菌悬液进行擦伤接种,结果发现甘薯发病程度偏重,可能是由于接种菌液浓度过高引起的[18]。为此,本文通过对接种菌液进行不同浓度的稀释,以确定甘薯茎腐病抗性鉴定的最佳接种菌液浓度。
以中感甘薯品种浙薯33为研究材料,采用上述试验中最佳的接种方法进行培养,以浓度为4.4×108CFU·mL-1的菌悬液(D600=0.2)作为母液,通过稀释不同浓度(稀释1倍、10倍、40倍、100倍和1 000倍)进行接种,即接种菌液浓度梯度为2.2×108、4.4×107、1.1×107、4.4×106和4.4×105CFU·mL-1。以无菌水为对照,每种浓度重复3次。
1.4 新抗茎腐病鉴定技术的验证与应用
选取甘薯品种和不同的接种方法,确定最佳的接种方式和接种菌液浓度,建立鉴定标准。选择最具代表性的6个代表性甘薯品种材料,采用最佳的接种方式和接种菌液浓度进行室内鉴定,与田间抗性品种比较的验证,以确定该抗茎腐病鉴定技术的准确性。并对65个甘薯材料进行抗病鉴定,在接种后一段时间内观察甘薯的发病情况,根据鉴定标准对甘薯品种的抗病性进行评估,并给出相应的分级标准。
通过多次重复测定试验,根据甘薯整体品种材料的发病症状特点与抗性表现,结合田间病圃实际结果以及相关参考文献资料,参照文献的病害分级标准[19],加以改进:根据病情类型分为0级(高抗)、1级(抗病)、3级(中抗)、5级(中感)、7级(感病)以及9级(高感)这六种类型,其中各病级对应症状的表型见表1。
表1 甘薯茎腐病薯苗接种病情分级标准Table 1 Grading criteria for inoculation of sweet potato stem rot seedlings
以作物病情指数(DI)来评价作物抗病性是常用的科学评价方法[20],参照此标准,对甘薯茎腐病病情指数进行计算。甘薯茎腐病病情指数(DI)的计算公式如下:
式中:VDI,病情指数的值;Pi,各级发病株数;Di,各级代表值;P,调查总株数;Dm,最高级代表值。根据参与鉴定全部甘薯品种材料的发病与抗性表现,结合田间病圃实际结果,参照文献的评价标准[21],确定甘薯茎腐病抗病性按病情指数(DI)来评价的抗性评价分类为抗病(R)、中抗(MR)、中感(MS)、感病(S)。抗性评价标准病情指数区间见表2。
表2 甘薯茎腐病抗病性评价标准Table 2 Evaluation criteria for resistance to stem rot of sweet potato
2.1 不同接种方法对薯苗发病程度的影响
实验结果表明,薯苗经不同接种方法接种菌液后,均能引起薯苗发生茎腐病甚至死亡,但不同接种方法间发病程度、稳定性与效果仍存在很大差异(图1、表3)。
图1 不同接种方法薯苗茎腐病发病死亡率Fig.1 Mortality rate of stem rot of potato seedlings by different inoculation methods
表3 甘薯茎腐病不同接种方法效果比较Table 3 Comparison of the effectiveness of different inoculation methods for sweet potato stem rot
试管菌液插苗法具有快速发病和高发病率的特点,但发病过于严重(图2-A),无法区分品种的抗性;组培瓶蛭石菌液浸苗扦插法也存在类似问题。组培瓶蛭石薯苗针刺法发病严重且不稳定。水泥槽蛭石拌菌移栽法发病缓慢且条件不易控制。组培瓶蛭石扦插灌根法和盆栽土壤扦插接菌法发病缓慢,时间周期长且发病率低(图2-B)。经多次实验表明,组培瓶蛭石薯苗擦伤接菌法接种最优。该方法易于控制温度、湿度等相关条件,发病率较为一致。初始发病时,薯苗擦伤接种部分出现水渍状斑,随着时间的推移逐渐变成黑褐色软腐斑,病部伴有恶臭味,随后甘薯茎基腐烂死亡(图2-C)。该症状与田间茎腐病相似。
A,试管菌液插苗法;B,盆栽土壤扦插接菌法;C,组培瓶蛭石薯苗擦伤接菌法。A, Tube innoculation method; B, Potting soil inoculation method; C, Scratch innoculation method of seedlings in tissue culture bottles with vermiculite.图2 不同接种方法的薯苗发病情况Fig.2 Morbidity of potato seedlings by different inoculation methods
2.2 不同接种菌液浓度对薯苗发病程度的影响
采用组培瓶蛭石薯苗擦伤接菌法对不同接种菌液浓度的薯苗进行处理。研究结果表明,经母液稀释40倍(1.1×107CFU·mL-1)菌液浓度接种后的效果最佳,接种2～3 d后薯苗开始显症,在擦伤接菌部出现水渍状斑,后期形成黑褐色软腐斑,甚至导致甘薯茎基腐烂死亡,该症状与田间茎腐病相似(图3);经母液(4.4×108CFU·mL-1)、稀释1倍(2.2×108CFU·mL-1)和10倍(4.4×107CFU·mL-1)的接种菌液处理后的薯苗,其抗性评价仍高于中感级别;经稀释100倍(4.4×106CFU·mL-1)和1 000倍(4.4×105CFU·mL-1)的接种菌液浓度处理后,薯苗发病率低、病症轻且显症极慢。基于上述结果,明确甘薯茎腐病抗性鉴定的最佳接种菌液浓度为1.1×107CFU·mL-1。
图3 接种菌液不同浓度薯苗茎腐病发病死亡率Fig.3 Mortality rate of stem rot of potato seedlings inoculated with different concentrations of bacterial solution
2.3 新抗茎腐病接种鉴定技术的验证
本文选取了7个具有代表性的甘薯品种(浙紫薯1号、FM11、浙薯38、浙薯33、浙薯13、浙733和浙薯26),采用组培瓶蛭石薯苗擦伤接菌法对其进行室内接种抗性鉴定,接种菌液浓度为最适菌液浓度1.1×107CFU·mL-1,同时在基地自然病圃进行田间抗性品比,最终调查结果显示室内接种抗性鉴定结果与田间抗性表现基本一致(图4)。因此,可以确立新抗茎腐病鉴定技术方法为采用组培瓶蛭石薯苗擦伤接菌法、接种菌液浓度为1.1×107CFU·mL-1。
图4 甘薯品种室内抗茎腐病鉴定结果与田间抗性品比的验证Fig.4 Validation of the results of indoor identification of sweet potato varieties for resistance to stem rot with field resistance ratios
2.4 新抗茎腐病鉴定技术的应用
通过新抗茎腐病鉴定技术,采用dd1、dd2的混合菌株对65个甘薯品种材料进行了抗茎腐病室内接种鉴定,该方法接种甘薯植株病情扩展迅速,接种后6 d感病品种发病可达9级;品种抗性区分度较好,接种6 d后品种间病情指数表现为0.9～77.4(表4)。
表4 甘薯品种资源对茎腐病抗性鉴定结果Table 4 Results of the identification of sweet potato variety resources for resistance to stem rot
根据甘薯茎腐病抗病性评价标准,鉴定品种材料中有7个品种材料病情指数(DI)≤5,表现为抗病,占鉴定材料的10.8%,分别为YD7002、DY7082-1、浙紫薯1号、TF1118、DY7032、南薯88、浙紫薯4号;有12个品种材料病情指数在5
图5 六十五个甘薯种质资源中对茎腐病各抗性水平占比Fig.5 Percentage of each level of resistance to stem rot in 65 sweet potato germplasm resources
选育和种植甘薯抗病品种是防治茎腐病的有效措施,需进行抗性鉴定。建立简便准确的接种鉴定方法是研究不可或缺的前提。目前报道甘薯茎腐病抗性的研究较少,本文设计了不同薯苗扦插栽培方式、病菌不同接种方式对其进行接种鉴定。采用不同的人工接种方式,甘薯茎腐病的发病程度具有明显差异。利用试管菌液插苗法和组培瓶蛭石菌液浸苗扦插法进行鉴定,发现这两种方法导致了较严重的发病情况,难以区分不同甘薯品种的抗性,在实际应用中的可行性较低;组培瓶蛭石薯苗针刺法、水泥槽蛭石拌菌移栽法、组培瓶蛭石扦插灌根法和盆栽土壤扦插接菌法,这些方法都展现出了一定程度的优势,发病较为缓慢且稳定,条件易于控制。然而,组培瓶蛭石薯苗针刺法的发病程度严重且不稳定,可能由于针刺导致的伤口感染引起了过度的病原菌侵染。水泥槽蛭石拌菌移栽法表现出一定的成活率和抗性评价,但发病缓慢且条件不易控制,因此,在实际应用中可能存在一些局限性。组培瓶蛭石扦插灌根法和盆栽土壤扦插接菌法的发病程度较缓慢,时间周期长且发病率低,这些方法适于对抗性的长期评估。而组培瓶蛭石薯苗擦伤接菌法通过在薯苗表面进行擦伤,使病原菌更容易侵入,从而真实地反映了田间茎腐病的发病情况。与其他方法相比,该方法处理间发病较为一致,病势进展适宜,且条件易于控制。由此可以更准确地评估甘薯的抗性,并筛选出具有稳定抗性的种质资源。因此,该方法将成为甘薯茎腐病抗育种的重要工具。
此外,接种菌液浓度的差异也会影响甘薯抗性评价。将接种菌液浓度分别稀释不同浓度(稀释1倍、10倍、40倍、100倍和1 000倍)进行接种,以确定甘薯茎腐病抗性鉴定的最佳接种菌液浓度。经高浓度处理后的薯苗,其抗性评价高于中感级别,低浓度处理的薯苗发病较轻,显症慢;而用稀释40倍(1.1×107CFU·mL-1)时的接种菌液进行组培瓶蛭石薯苗擦伤接种效果明显,能够真实反映甘薯幼苗抗性。由此可见,浓度为1.1×107CFU·mL-1的接种菌液可作为最佳浓度,以进行甘薯接种鉴定。
利用组培瓶蛭石薯苗擦伤接菌法与最佳接菌浓度(1.1×107CFU·mL-1),建立了一种新的抗性鉴定技术。通过选取6份最具代表性的甘薯种质材料进行室内接种抗性鉴定,其发病情况与田间抗性相一致。进一步对65份甘薯种质材料进行抗茎腐病鉴定,发现绝大部分材料表现为感病或中感,其中有7份甘薯种质表现为抗性,这些具有稳定抗性的种质将成为甘薯茎腐病抗育种的重要资源,可以进一步利用这些种质进行遗传育种和分子标记辅助选择[22],开展甘薯抗茎腐病育种工作。虽然采用此方法进行筛选抗性品种的效果佳,显症明显,但由于田间接种易受病原菌传播、年度气候、地理环境、管理措施等多种因素的影响,鉴定结果往往与室内存在差异[23],仍需要进一步在田间进行抗性鉴定,以明确此接种方法的有效性。
综上所述,甘薯抗茎腐病鉴定技术的建立及种质资源抗性分析是甘薯育种中的重要研究内容,对于提高甘薯生产效益和促进其产业健康发展具有重要的意义。未来应进一步深入研究甘薯抗茎腐病的分子机理和遗传规律,加速抗病种质资源的筛选和开发,为甘薯育种和产业发展提供更加精准的技术支持。
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