彭禹熙，樊双喜，张 娅，李细芬，尹学忠，王国江，杨礼红，侯玉祥，卢 君*，李长文
（1.贵州国台酒业集团股份有限公司，贵州仁怀 564501；
2.贵州国台酒业集团研究院，天津 300410）
2,3-丁二酮（2,3-butanedione，C4H6O2）又称双乙酰，稀溶液呈现出奶油、酸奶的气味。适量的2,3-丁二酮对白酒具有重要的风味作用，有助于进口喷香，增强香味感知，但当酒体中2,3-丁二酮含量失调时，会使酒体在感官上呈现出“馊饭味”“发闷”的感受，显著影响白酒品质[1-5]。因此，迫切需要建立一套快速、方便、准确定量检测白酒中2,3-丁二酮的方法。
目前食品中的2,3-丁二酮的检测方法主要包括紫外分光光度法[6-7]、荧光分光光度法[8]、高效液相色谱法[9-10]以及气相色谱法等[5，11，12，14]。其中，分光光度法是最常用的方法，如GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》中规定采用邻苯二胺比色法测定啤酒中2,3-丁二酮的含量，然而，该方法不能排除结构类似产物的测定干扰，会使检测结果偏高。液相色谱法测定2,3-丁二酮需要进行化学衍生，过程费时费力，会造成结果误差[13]。气相色谱法主要包括直接进样-气相色谱法（direct injection-gas chromatography-flame ion detector,DI-GC-FID）、顶空进样气相色谱法（headspace sampling-gas chromatographyflame ion detector,HS-GC-FID）和固相微萃取结合气相色谱/质谱法（solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,SPME-GCMS）。MACCIOLA 等[11]建立了气相色谱法（GC）测定乳制品中2,3-丁二酮的新方法，该方法只需丙酮作为溶剂，样品的制备简单、快速、节省成本。TIAN 等[12]建立了一种基于HS-GC-FID 快速定量分析啤酒中2,3-丁二酮含量的方法，该方法具有良好的准确性和精密度。王莉等[5]采用静态顶空与气质联用（GC-MS）相结合建立了一种定量分析白酒中2,3-丁二酮的方法，该方法实现了对不同香型白酒中2,3-丁二酮的定量分析。CHEN 等[14]基于SPME 与GC-MS 技术，建立了定量测定黄油和空气样品中的双乙酰的方法，该方法操作简单，结果准确可靠。以上方法采用HS 或SPME 作为样品前处理方式，样品之间的气液平衡可能会受到基质成分的影响，影响测定结果的重复性和回收率。如不选择适当的内标物作为对照，采用HS 或SPME 测定2,3-丁二酮的结果也可能不够准确[15]。此外，直接进样相对于HS、SPME 而言，无需进行挥发性成分的提取和浓缩，大大减少了物质提取过程中的损耗，同时对比MS 检测器，FID 能够满足白酒样品直接进样的需求[16]。
本研究采用直接进样结合GC 技术，通过优化检测方法条件，研究建立了GC 外标法定量分析检测酱香型白酒中2,3-丁二酮的方法，为酱香型白酒质量控制提供了检测技术及方法支撑。
1.1 材料、试剂及仪器
酒样：33 款酱香型白酒成品酒，分别编号为J1—J33，市售。
试剂及耗材：2,3-丁二酮（色谱级，＞99%），麦克林；
乙醇（色谱级），科密欧化学试剂有限公司。
仪器设备：Agilent 8890 气相色谱仪，Agilent；
ME204T 电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；
Gen Pure xCAD Plus 纯水机，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；
0.22 μ m有机滤膜，比克曼生物科技有限公司；
1 mL 一次性注射器，康城医疗器械。
1.2 实验方法
1.2.1 标准溶液的制备
（1）53%vol 乙醇溶液：量取265 mL 乙醇（色谱级）加二纯水定容于500 ml 容量瓶中，摇匀，即得53%vol乙醇溶液。
（2）2,3-丁二酮储备液：精确称取2,3-丁二酮标准品23.50 mg 于100 mL 容量瓶中，用53%vol 乙醇溶液定容，得到浓度为235 mg/L 2,3-丁二酮储备液。
（3）2,3-丁二酮工作液：用移液管精确移取2,3-丁二酮储备液0.3 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL 于10 mL 容量瓶中，用53%乙醇溶液定容，混合均匀，配制成不同梯度2,3-丁二酮工作液，各浓度分别为7.05 mg/L、11.75 mg/L、23.50 mg/L、35.25 mg/L、47.00 mg/L、70.50 mg/L、94.00 mg/L、117.50 mg/L。
1.2.2 样品前处理
采用直接进样的前处理方法，样品需过膜去除杂质。取酒样摇匀后放置磨口玻璃瓶内待用，取适量样品过0.22 μ m 滤膜后置于进样小瓶，供GC分析。
1.2.3 仪器检测条件
GC条件：采用HP-FFAP色谱柱（50 m×0.2 mm，0.33 μ m，型号：19091F-105）；
进样口温度为200 ℃，检测器温度220 ℃；
程序升温为初始柱温40 ℃，保持2 min，以3 ℃/min 升温至90 ℃，再以15 ℃/min 升温至230 ℃，保持20 min；
载气为高纯氮气（纯度＞99.999 %），流量控制方式为恒流模式，流量1 mL/min；
进样方式为分流进样，分流比1∶20；
进样量为1 μ L。
1.2.4 定性定量方法
利用2,3-丁二酮标准品的保留时间，对目标物进行定性。将不同浓度的2,3-丁二酮工作液按照上述样品处理方法处理后进行仪器分析，以2,3-丁二酮峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，进行定量分析。
2.1 检测条件优化
2.1.1 柱流量
柱流量会影响样品谱图色谱峰形状，流速过小会导致谱图呈现矮宽峰，流速过大则会造成色谱柱中固定相物质的流出，本实验研究对比了柱流量分别为0.9 mL/min、1.0 mL/min、1.1 mL/min 时气相色谱对2,3-丁二酮的分离效果，结果发现柱流量对其分离效果影响不大。因此，结合色谱柱常用柱流速，最后选择1 mL/min为本研究柱流量检测条件。
2.1.2 分流比
分流比较大，会造成溶剂拖尾对目标峰产生遮掩；
分流比较小，会造成目标峰峰型较差或者被基线噪声掩盖[17]。本实验对比了分离比分别为1∶10、1∶20、1∶30 时2,3-丁二酮的分离效果，当分流比为1∶10时，会出现目标峰2,3-丁二酮与左边干扰峰乙酸丙酯共流出的现象，2,3-丁二酮不能得到很好的分离；
提高分流比到1∶20 时，目标峰2,3-丁二酮可以与乙酸丙酯得到很好的分离且峰型良好（详见图1）；
当分流比为1∶30 时，虽然目标峰2,3-丁二酮可以得到分离但其峰型较差。因此，选择分流比1∶20作为最佳分流比。
图1 白酒气相色谱图（分流比1∶20）
2.1.3 升温程序
升温程序影响分配系数、分配比，从而影响分离度和分析时间。升温速度慢，峰型扁平，分析时间长；
升温速度快，分配系数小，不能达到有效分离[18]。本实验选择优化40 ℃升至90 ℃这段升温速率，对比了升温速率分别为2 ℃/min、3 ℃/min、4 ℃/min时气相色谱对2,3-丁二酮的分离效果。当升温速率分别为2 ℃/min、3 ℃/min 时，2,3-丁二酮都可以得到很好的分离效果；
当升温速率为4 ℃/min 时，部分实验样品会出现2,3-丁二酮与左边干扰峰乙酸丙酯共流出的现象。综合考虑时间和分离效果，优化后柱温箱的升温程序为：初始柱温箱40 ℃，保持2 min，以3 ℃/min 升温至90 ℃，再以15 ℃/min升温至230 ℃，保持20 min。
2.2 方法的线性范围、检出限与定量限
通过优化检测条件（柱流量、柱温箱升温速率和分流比），得到最终的GC 检测方法为：柱流速为1 mL/min，分流比1∶20，柱温箱的升温程序为：初始柱温箱40 ℃，保持2 min，以3 ℃/min 升温至90 ℃，再以15 ℃/min升温至230 ℃，保持20 min。后续将展开直接进样-气相色谱检测2,3-丁二酮的方法学验证。
按1.2.1 进行2,3-丁二酮工作液的配制，各吸取1 μ L 注入气相色谱仪，记录色谱图，以目标峰的质量浓度为横坐标（x），以目标峰的峰面积为纵坐标（y），进行线性回归，绘制标准曲线。2,3-丁二酮的线性方程、相关系数、线性范围和检出限，详见表1。由表1 可知，该方法在质量浓度7.05～117.50 mg/L 范围内线性关系良好，相关系数（R2）≥0.998。利用2,3-丁二酮工作液的最低浓度水平为依据，3 倍信噪比计算检出限，10 倍信噪比计算定量限，得到2,3-丁二酮的检出限为0.67 mg/L（S/N=3），定量限为2.24 mg/L（S/N=10），结果表明，该方法能够满足酱香型白酒中2,3-丁二酮的定量检测需求。
表1 方法线性方程、相关系数、线性范围、检出限与定量限
2.3 精密度试验与加标回收率试验
2.3.1 精密度试验
精密度试验可分为分析重复性测试、进样重复性测试以及中间精密度测试。
分析重复性测试：对同一待测样品，按照1.2.2要求进行前处理，同时制备6 份测试溶液，上机检测，计算分析目标物含量的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。
进样重复性测试：取任一制备好的样品，按照1.2.2要求进行样品前处理，重复进样6 次，上机检测，计算分析目标物含量的RSD值。
中间精密度测试：按照上述前处理方法和仪器条件，随机取一份供试样品，分别由同一人员在不同天数进行测定，计算不同天数检测目标物含量的RSD值。
精密度试验具体结果，详见表2。由表2 可以看出，2,3-丁二酮分析重复性测试结果RSD 为0.85 %，进样重复性测试结果RSD 为0.41 %，中间精密度测试结果RSD 为1.44 %，表明该方法精密度良好，符合分析精密度要求。
表2 方法精密度
2.3.2 加标回收率试验
取同一批白酒样品适量，按照上述前处理方法和仪器分析条件进行分析。根据该样品中2,3-丁二酮的实际浓度，按50 %、100 %、150 %三个水平分别添加，每个水平平行六份，以标准曲线法计算供试样品及加标样品中2,3-丁二酮的含量，考察该方法的加标回收率。加标回收率=（加标样品平均测得量-样品平均测得量）/加标量*100%。2,3-丁二酮的加标回收率测试结果，如表3 所示。由表3可知，2,3-丁二酮的加标回收率在82.77 %～112.61 %之间，均在允许回收率限度范围内，结果表明该方法回收率良好，符合分析加标回收率要求。
表3 方法加标回收率
2.4 酒样检测
利用本实验所建立的分析方法，对市售33 款酱香型白酒样品的2,3-丁二酮含量进行检测，每个样品平行测定2 次，计算平均值，检测结果见表4。由表4 可知，32 款白酒样品中均检测出了2,3-丁二酮，含量在3.97～29.49 mg/L 之间，32 款酱香白酒样品的2,3-丁二酮含量的平均值为9.99 mg/L，标准偏差为5.42 mg/L。2,3-丁二酮在酱香白酒中普遍存在且含量差异明显，酱香白酒的风味协调与稳定性是由各种风味物质共同作用的结果，某种成分含量过高或过低都会影响酱香型白酒的香气协调，感官上会造成不愉悦的感受。
表4 33款酱香型白酒中2,3-丁二酮测定结果
本试验建立了直接进样-气相色谱（DI-GC）外标法定量分析酱香白酒中2,3-丁二酮的方法。通过对方法参数（柱流速、分流比和柱温箱升温程序）进行优化及确认，验证及考察了该方法的线性范围、检出限、定量限、精密度和准确性。结果表明，该方法在质量浓度7.05～117.50 mg/L 范围内线性关系良好（R2=0.998）；
检出限为0.67 mg/L（S/N=3），定量限为2.24 mg/L（S/N=10）；
加标回收率范围在82.77 %～112.61 %之间；
日内与日间RSD 分别为0.41 %和1.44 %。对市售33 款酱香白酒中的2,3-丁二酮含量进行测定，结果表明，32 款酱香白酒中含量范围在3.97～29.49 mg/L 之间，平均值为9.99 mg/L，标准偏差SD=5.43 mg/L。2,3-丁二酮在酱香型白酒中普遍存在，不同酱香白酒样品中2,3-丁二酮的含量表现出一定的差异。2,3-丁二酮是酱香白酒风味相关的重要指标，其含量过高或过低会造成白酒感官风味的不协调，影响酒体品质。本研究建立的基于GC-FID 检测酱香型白酒中2,3-丁二酮的测定方法，具有操作简单、准确性高、重复性好等特点，可以广泛推广应用于酱香型白酒中2,3-丁二酮含量测定。