王梦文, 杜佳霖, 董 睿, 李鹏博, 李 铜, 金光德, 南桂仙
(延边大学 农学院,吉林 延吉 133002)
白鲜(DictamnusdasycarpusTurcz.)属芸香科白鲜属多年生宿根草本植物,其根部入药,又称白鲜皮、山牡丹等,经常用于治疗湿热疮毒、黄水淋漓、湿疹、风疹等疾病[1],还被证实有抗炎、抗真菌、止血、抗癌等药理作用[2],因此,其需求量不断增加。近年研究表明,白鲜碱等生物碱类,黄柏酮、梣酮等柠檬苦素类化合物为白鲜主要有效成分[3],具有多种生物活性。其中,白鲜碱具有强心、抗虫、抗真菌等活性[4-5],黄柏酮具有抗癌、抗肿瘤的细胞毒性等活性[6-7];梣酮具有良好的护肝作用,同时具有抗菌、杀虫等活性[8-11]。在中国、韩国和日本多用于治疗皮肤疾病[12]。由于对野生白鲜的过度开发,导致白鲜产量供不应求,如何合理利用药用资源提取更多的次生代谢产物是该试验的目的与初衷。
目前,诱导子在药用植物次生代谢产物的提升方面被广泛应用,诱导子从来源上可分为外源性和内源性,根据性质可分为生物型和非生物型[13]。利用不同诱导子影响白鲜幼苗以提高其药用成分含量(白鲜碱、梣酮、黄柏酮)和次生代谢产物的研究报告愈发增多。其中,AgNO3作为常用的外源诱导子,已应用于药用植物促进其生长和提升次生代谢产物的研究。但是,目前其对于白鲜生长和次生代谢产物调控的研究鲜有报道。张志军等[14]的研究表明,AgNO3对马铃薯幼苗的根长有促进作用;许建民等[15]的研究表明,AgNO3对草莓组培苗的生长有促进作用,郭双等[16]研究表明,AgNO3可提高颠茄毛状根中的生物碱含量。该试验以白鲜种子作为试验材料,探究经不同浓度AgNO3处理后对白鲜试管无菌苗生长以及药用成分含量的影响,以期为白鲜次生代谢产物调控研究与规模化生产提供理论基础。
1.1 材料
该试验的植物材料为白鲜种子,采收于安图白鲜栽培地。
仪器和试剂：SW-CJ-1FD超净工作台(上海新苗医疗器械制造有限公司)、1260高效液相色谱仪(High Performance Liquid Chromatography,HPLC,美国安捷伦公司)、SB-120D超声波清洗机(宁波新芝生物科技有限公司)、乙醇、甲醇(色谱纯)、AgNO3(上海麦克林生化科技股份有限公司)、蒸馏水、MS培养基粉(青岛高科技工业园海博生物技术有限公司)、白鲜碱标准品、黄柏酮标准品、梣酮标准品(上海源叶生物科技有限公司),无特殊标记外的试剂均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 试验设计
将消毒后的白鲜种子点在MS培养基中,待种子发芽后分别移到附加不同浓度AgNO3诱导子的MS培养基中培养,浓度分别为0.1、0.5、1、5、10、50、100、150 μmol/L,以不加诱导子的MS培养基为对照(CK),每个培养基点10粒种子,4个培养基为1组,重复3次,培养30 d后观察白鲜幼苗生长情况,其中添加AgNO3诱导子的培养基先暗培10 d再进行光照,CK培养方式相同。培养温度(24±1) ℃,光照时间14 h/d。
1.2.2 计算方法
该试验对白鲜幼苗根长、侧根数、鲜重净增量、干重净增量进行测量。其中,在测定根长时一组为20个幼苗根长平均值,在统计侧根数时一组为20个幼苗侧根数平均值,上述每个处理重复4次。鲜重净增量=处理后10棵幼苗鲜重-处理前10粒种子鲜重;干重净增量=处理后10棵幼苗干重-处理前10粒种子干重。
1.2.3 检测方法与色谱条件
该试验采用加热回流装置和高效液相色谱法检测白鲜中的白鲜碱、梣酮、黄柏酮含量。检测方法参考贾晓龙[17]的试验方法,色谱条件：色谱柱为YMC-Triart-C18(250 mm×4.60 mm, 5 μm);流动相为甲醇(55)：水(45),流速 1 mL/min;白鲜碱、梣酮检测波长为 236 nm,黄柏酮检测波长为 212 nm[18];色谱柱温度25 ℃;进样量10 μL。
1.3 溶液的制备
1.3.1 标准品母液
将50 mg白鲜碱、梣酮、黄柏酮标准品加入甲醇中定容至50 mL,制得浓度为1 mg/mL的母液。
1.3.2 待测样品溶液
将植物样品放入烘干箱55 ℃烘干3～4 h,温度提高到100 ℃烘干1～2 h,冷却后研磨,取1.0 g样品,放入锥形瓶中,加入甲醇25 mL,加热回流1 h,水浴温度60 ℃,冷却取混合液补充少量甲醇并通过0.22 μm微孔过滤,即得样品待测液。每个浓度重复3次。
1.4 线性关系的考察
分别吸取适量的白鲜碱、梣酮、黄柏酮标准品母液分别置于20 mL容量瓶中,加入甲醇定容,分别得到不同质量浓度的白鲜碱、梣酮、黄柏酮标准品溶液,此时白鲜碱的质量浓度为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 μg/mL;梣酮的质量浓度为5、25、45、65、85、105、125、145 μg/mL;黄柏酮的质量浓度为15、45、75、105、135、165、195 μg/mL。取得不同质量浓度的白鲜碱、梣酮、黄柏酮标准品溶液后,在1.2.3的色谱条件下测定峰值。以质量浓度X为横坐标,峰面积值Y为纵坐标,绘制标准曲线,并计算不同浓度的标准品质量浓度对峰面积的回归方程(表1)。
表1 白鲜碱、梣酮、黄柏酮标准品质量浓度对峰面积的回归方程
表2 检测供试验品中白鲜碱、梣酮、黄柏酮含量的重复性试验
1.5 精密度试验
分别取0.1 mg/mL的白鲜碱、梣酮、黄柏酮标准品母液,在1.2.3的色谱条件下,连续进样5次进行检测,白鲜的峰面积平均值为1 348 416.667、梣酮的峰面积的平均值为1 001 977.56、黄柏酮的峰面积平均值1 999 289.333,相对标准偏差RSD分别为1.67%、1.59%、1.38%,均<2%,结果说明精密度好,符合分析要求。
1.6 重复性试验
称取同一浓度处理的白鲜幼苗,按照“1.3.2”流程制作供试样品溶液,在1.2.3色谱条件下,连续进样5次,测定并计算白鲜碱、梣酮、黄柏酮含量的RSD,均<2%,结果表明重复性很稳定,符合分析的要求。
1.7 试验数据分析
该试验采用Excel进行数据汇总,SPSS 26统计软件对试验数据进行单因素方差分析和主成分分析。
2.1 不同浓度AgNO3对白鲜试管无菌苗生长的影响
2.1.1 不同浓度AgNO3对白鲜试管无菌苗根部生长的影响
不同浓度AgNO3处理后白鲜试管无菌苗根的生长和侧根数均出现了显著差异(表3)。白鲜幼苗的根长和侧根数随着AgNO3浓度的增加呈现先提升后减少的趋势。
由表3可知,AgNO3所有浓度处理后均对白鲜幼苗根的生长有促进作用,所用浓度处理根的生长都显著优于CK。在10 μmol/L时根长达到最大值,长度为8.75 cm,在0.1 μmol/L较低浓度的时候,根长最低,长度为5.64 cm。所有AgNO3浓度处理后侧根数均显著高于CK,在0.5 μmol/L时,白鲜幼苗侧根数最多,为2.43条,在浓度为50 μmol/L时,侧根数显著下降,到150 μmol/L时,达到最低值。
2.1.2 不同浓度AgNO3对白鲜试管无菌苗鲜重和干重的影响
不同浓度AgNO3处理下的幼苗鲜重净增量均高于CK(表4)。AgNO3浓度为0.5 μmol/L时,鲜重净增量最多,平均重量为1 036.13 mg。AgNO3各浓度处理后干重净增量均高于CK。AgNO3浓度为0.5 μmol/L时,干重净增量达到最高值,重量为146.93mg。浓度为150 μmol/L时,在所用浓度处理中干重净增量最低。
表4 不同浓度硝酸银处理后的白鲜幼苗的鲜重和干重净增量
2.2 不同浓度AgNO3对白鲜试管无菌苗药用成分含量的影响
不同浓度AgNO3处理后白鲜幼苗中的3种药用成分含量均产生了显著差异(表5)。3种药用成分含量随着AgNO3浓度的增加整体呈现先上升后下降的趋势。在AgNO3浓度为50 μmol/L时,白鲜碱含量达到最大值,为317.40 μg/g,在AgNO3浓度为0.1 μmol/L时,相比其他浓度处理白鲜碱含量最少,为117.11 μg/g,但显著高于CK。在AgNO3浓度为1 μmol/L时,梣酮含量最高,为201.16 μg/g,在浓度为5 μmol/L时,开始缓慢下降。在AgNO3浓度为150 μmol/L时,梣酮含量达到最低。在AgNO3浓度为0.5 μmol/L时,黄柏酮含量达到最大值,为374.42 μg/g,当浓度为1 μmol/L时,黄柏酮含量缓慢降低,到50 μmol/L时,黄柏酮含量显著低于CK。
表5 不同浓度硝酸银处理对白鲜中白鲜碱、梣酮、黄柏酮的影响
2.3 不同浓度AgNO3对白鲜试管无菌苗生长和药用成分含量的主成分分析
以不同浓度AgNO3处理后白鲜幼苗根长、侧根数、生物量和3种药用成分含量共7个指标进行主成分分析,通过综合评价筛选出AgNO3的最佳浓度。将上述各项指标的数据经标准化处理后,计算相关矩阵的特征值和所对应的特征向量(表6)。
表6 相关矩阵特征值和特征向量
结果表明,前3项综合指数的特征值>1,积累贡献率为93.48%,因此可代表原来的所有指标绝大部分信息。主成分1主要综合了侧根数(0.930)、干重净增量(0.833)、梣酮含量(0.659)和黄柏酮(0.764),代表原始数据信息量的49.075 %,主成分2主要综合了根长(0.778)和白鲜碱含量(0.886),代表原始数据信息量的27.253 %,主成分3为鲜重净增量(0.664),代表原始数据信息量的17.152 %。
由AgNO3所有浓度处理后的综合得分排名可知,AgNO3对白鲜生长和3种药用成分总含量促进作用最为明显的浓度为0.5 μmol/L,其次是5 μmol/L、10 μmol/L(表7)。
表7 硝酸银各浓度主成分得分及综合排名
药用植物是生产多种天然化合物的高等植物种类[19],根据主效成分划分为黄酮类、 生物碱类等植物[20]。白钢等[21]认为,植物中的特殊药用成分能增强体质、改善脏腑功能。药用植物是中药的重要组成部分,我国对药用植物的需求量非常巨大[22]。白鲜中的药用成分具有清热燥湿、祛风解毒之功,可用于湿热疮毒、黄水淋漓、湿疹、风疹、疥癣疮癞、风湿热痹、黄疸尿赤等[23]。随着白鲜皮的广泛应用,价格呈逐年上涨趋势,在东北三省及内蒙古等地区进行人工栽培,但由于相关生产操作规范不完善,市场流通的白鲜皮饮片有效成分含量不稳定,部分饮片不符合国家标准[24]。冷豆豆等[25]认为,通过诱导子可以调控植物代谢途径和药用含量。AgNO3作为常用的诱导子,是乙烯合成酶ACC的一种抑制剂[26],Ag+不仅可以调控细胞内的抗氧化酶活性[27],还能促进植物再生、促进根的生长[28]。刘佳等[29]研究发现,AgNO3浓度在50、100 μmol/L时,均显著性地提高了托品烷类生物碱的产量;高湖川[30]试验表明,AgNO3浓度在50 μmol/L时,喜树碱的含量相对增加 70.28%;李婷婷等[31]试验证明,AgNO3浓度在0.4g/L时,抑制刺梨叶片愈伤组织褐化的效果最好;前人的研究结果表明, AgNO3对植物的次生代谢有调控作用,与该试验研究结果基本一致。但因AgNO3为有毒物质,利用不同浓度的AgNO3处理白鲜种子后白鲜幼苗中AgNO3残留的毒性大小尚未检测,如何消除AgNO3残留的毒性有待研究。此外,AgNO3在50～150 μmol/L时,浓度跨度较大,在这之中是否还有更具体的浓度变化值仍需进一步探究。
用不同浓度AgNO3处理白鲜已萌发种子,30 d后测定了白鲜幼苗根长、侧根数、干重净增量、鲜重净增量和3种药用成分含量,对测定得到的数据进行方差分析结果产生了显著差异。对不同浓度AgNO3处理下白鲜幼苗的各项指标进行主成分分析,结果表明0.5 μmol/L AgNO3处理下各项指标的综合排名最高。
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