杨 平，奉永友，黄祥明，王 顺，兰景超，吴孔菊，唐浩元，方 俊
（成都大熊猫繁育研究基地，四川省濒危野生动物保护生物学重点实验室，成都，610081）
大熊猫（Ailuropoda melanoleuca）属食肉目（Carnivora）熊科（Ursidae），是国家一级重点保护野生动物，有“活化石”和“国宝”之称。大熊猫胚胎有延迟着床的现象，环境适宜后才开始在子宫内着床分化形成胎儿［1-3］，大熊猫妊娠期波动较大，一般85～201 d［4］，最长可达324 d［2］。即使胚胎成功着床，雌性大熊猫也可能因应激或其他未知原因发生流产［5］或胚胎被母体吸收［6］等情况。虽然大熊猫在妊娠后期的采食量显著减少并出现明显的妊娠行为［7］，但部分雌性大熊猫存在假孕现象，且假孕大熊猫在激素和行为上与真孕大熊猫极为相似，难以直接区分［8］。因此，采用激素［9］、行为［7］和孕期判断大熊猫是否怀孕通常容易出现误判［10-11］。
B 超是一种现代化辅助诊断技术，广泛应用于家畜临床生产，部分饲养繁育机构也用于大熊猫怀孕情况监测［6，8，12］。因大熊猫破坏性较强，麻醉对胎儿有影响且仅有部分大熊猫愿意配合工作人员完成特定动作，所以目前B 超少量应用于大熊猫孕体检查且均模仿孕妇B 超检查的仰躺体位［1，13-15］。但由于大部分大熊猫在妊娠后期食欲下降、行动谨慎、紧张和休息时间增多，尤其是减食后期雌性大熊猫无食欲、不愿动，大多数都拒绝配合行为训练特别是动作较大的行为如仰躺，致使只有极少数大熊猫在减食后期仍愿意完成仰躺体位且能配合完成孕体B 超检查。因此，有报道能配合完成非麻醉孕体B 超检查的大熊猫样本极少［1.6.16］，非麻醉孕体B 超检查仅限于实验室研究阶段，难以在生产中大规模推广。基于此，本研究通过探索减食期大熊猫自然表达且能配合完成非麻醉孕体B 超检查的合适体位，以期将孕体B 超技术在大熊猫繁育工作中大范围推广并指导生产。
1.1 研究对象
对成都大熊猫繁育研究基地2022 年配种的22只大熊猫（表1）进行孕体B超检查探索，因部分大熊猫紧张、不配合等原因，最后完成16 只孕体B 超检查。
表1 2022年配种大熊猫的基本信息Tab.1 The information about breeding giant pandas in 2022
1.2 饲养管理
雌性大熊猫完成配种后，按配种大熊猫管理。管理内容包括但不限于提供良好的外界环境条件和均衡营养，即提供单独且不受影响的饲养场地，保持环境安静，温湿度适宜，充分满足大熊猫对竹的需要，确保大熊猫血清钙磷含量正常，对于出现妊娠反应的大熊猫加强观察，采集尿样监测孕激素变化。
1.3 试验工具
训练专用口哨、目标棒、食物背桶（小铁盆）、针管、酸钙、苹果、窝头、耦合剂、B 超探头（废弃品）、百胜MyLab DeLta Vet 型超声诊断仪（SC3421腹部电子凸阵探头，超声频率1～8 MHz）、伸缩式训练笼和平板床。
1.4 试验方法
1.4.1 训练和脱敏
通过综合评估雌性大熊猫食物喜好和身体状态，个性化使用窝头、苹果、酸钙和蜂蜜水等食物对10 只雌性个体采用正增强方法开展仰躺行为训练和B 超脱敏（图1），训练期间严格遵循塑形十大原则，让大熊猫适应操作人员、B 超探头以及耦合剂。
图1 训练笼内的仰躺训练和B超脱敏Fig.1 The training of lying back and the desensitization by B-ultrasound in the training cage
1.4.2 工作小组及测量方法
大熊猫非麻醉孕体B 超检查小组工作期间需3 或4 人，一人操作B 超机记录图像，一人操作探头检查，1 或2 人分散大熊猫注意力并观察大熊猫状态提醒探头操作人员。
待被测大熊猫稳定后，工作人员首先梳理其腹部毛发暴露腹部皮肤（以直线的形状），然后在皮肤上涂抹藕合剂，再将MyLab DeLta Vet 型超声诊断仪的探头接触涂有耦合剂的皮肤，探测到胎儿后抓取图像和视频；
减食前每2 d 跟踪1 次；
减食后根据妊娠大熊猫配合程度而定，但每次进行B 超检查的前1 d晚上减少食物和饮水的供给。
1.4.3 记录指标
自妊娠大熊猫开始减食后，每天记录采食情况、粪便量及喜食的食物。
2.1 训练完成结果
因多种原因影响，参与行为训练的10 只大熊猫在减食前有6只能配合完成仰躺体位，4只不能完成仰躺体位和B超检查；
在减食后有7只大熊猫不配合完成仰躺体位和B超检查（其中有3只在减食前能完成仰躺体位和B 超检查），有3 只能配合完成仰躺体位和B 超检查，但是随着减食时间加长，睡觉时间增加，在减食后期参与行为训练的意愿降低，动作完成度明显变差，每次配合训练的时间明显缩短，B 超检查时间也极短（表2）。
表2 行为训练及脱敏完成情况Tab.2 The completion of training and desensitization
2.2 孕体B超检查配合情况
因大熊猫紧张、不配合检测等多种原因，2022年共对16只妊娠后期减食大熊猫完成B超检查，其中7只假孕，9只子宫内检查到孕体（5只单胎，4只双胞胎）。这16只大熊猫中有5只（奥林匹亚、家园、艾莉、绩丽和娅韵）在减食前完成仰躺训练和B 超检查，但在减食阶段只有2只（奥林匹亚、绩丽）继续配合完成仰躺训练和B超检查（图2），1只在减食后期拒绝仰躺而犬坐（娅韵）（图3），2只在减食后期不愿配合或配合意愿不高而趴、靠坐和侧躺（家园、艾莉）（表3）。
图2 奥林匹亚孕体B超检查Fig.2 The B-ultrasound examination of Aolinpiya
图3 减食前后的体位Fig.3 The postures before anorexia and after anorexia
表3 参与孕体B超检查的妊娠大熊猫Tab.3 The pregnant giant panda participated in B-ultrasound examination
16 只大熊猫中有11 只在减食前未完成仰躺训练和B超检测。其中，有4只纳入训练计划但未学会（雅韵、福禄、怡云和北川）；
7只未进行训练（文莉、二巧、香冰、成大、星辰、妮小和雅竹），但通过趴（图4）、侧躺（图5）、犬坐（图6）、倦坐（图7）、靠坐（图8）及半蹲（图9）等一种或多种体位配合完成了B超检查，其中星辰为野外放归大熊猫（图9，表3）。
图4 体位(趴)及胎儿（单胎和双胞胎）Fig.4 The posture（lying on its back）and the conceptus（single and twins）
图5 体位(侧躺)及单胎Fig.5 The posture（lying on its side）and the single conceptus
图6 体位(犬坐)及双胞胎Fig.6 The posture（sitting position of dog）and the twin conceptus
图7 体位(倦坐)及双胞胎Fig.7 The posture（curling）and the twin conceptus
图8 体位(坐靠)及单胎Fig.8 The posture（sitting back）and the single conceptus
图9 体位半蹲及野化放归（假孕）Fig.9 The posture（squatting）and the reintroduction（pseudopregnancy）
2.3 首次检查到孕体的时间
9 只产仔大熊猫在妊娠后期的减食总时长为21～32 d，首次发现孕体时减食时长差异较大，最短为9 d（孕体体长13.9 mm）（图10），最长为29 d；
减食时长在9～15 d 的有4 只，孕体体 长为13.9～36.9 mm；
首次同时发现双胞胎时减食时长最短为13 d，最长为29 d；
仰躺体位下首次发现孕体时减食时长约15 d（孕体体长16.0～21.3 mm），非仰躺体位下首次发现孕体时减食时长为9～11 d（孕体体长13.9～36.9 mm）（表4）。
图10 体长最短的孕体Fig.10 The conceptus with the shortest length
表4 首次检查到孕体的基本情况Tab.4 The information on detecting conceptus for the first time
3.1 首次B超检测到孕体的时间
本研究发现9只产仔大熊猫在妊娠后期的减食时长为21～32 d，首次发现孕体最早在产前13 d，一般集中在产前10～13 d，即妊娠大熊猫减食9～15 d（孕体体长为13.9～36.9 mm），与此前报道［4］一致。通过多次B超检查大熊猫发现，检查到孕体时B超探头的位置多集中在体表下乳头正下方5～10 cm的区域内，因此，可用其下乳头进行体表定位。妊娠B超诊断技术具有操作便捷、时间短、安全性高以及临床诊断价值高等优点，通过妊娠B超诊断能提前确定妊娠大熊猫是否怀孕，从而指导母兽的营养制定、饲养管理、产房调整以及育幼准备等工作，尤其是可以为母兽提前补充营养制剂，避免难产等异常情况，提高幼仔出生后的成活率［16］。此外，通过研究发现雌性大熊猫减食9～15 d时孕体体长为13.9～36.9 mm，此时减食时间较短，对母兽开展孕体B超检查配合度相对较高，孕体也较好识别。
3.2 妊娠母兽体位
目前，妊娠大熊猫孕体B 超检查均采用仰躺体位，虽然仰躺体位便于识别孕体，但对母兽要求较高。本研究中的10 只大熊猫参与行为训练在减食前仅有5 只配合仰躺和B 超检查，在减食后期上述5 只妊娠大熊猫中也只有3 只配合仰躺和B 超检查，特别是有一只大熊猫经过2 年强化训练，减食前配合度很高而减食后基本不采食食物、不理会口令、不愿配合或行为极差，即使配合完成仰躺的B 超检查，时间也极短。因此，训练大熊猫在减食期间采用仰躺配合进行孕体B超检查不具有大范围推广的可行性。
通过观察妊娠后期的大熊猫发现，部分妊娠大熊猫在减食后期性格温顺，喜欢休息，活动少，表达很多放松行为如趴在睡床上、走动后趴在地上、犬坐、侧卧、靠墙（睡床）而坐、倦坐及半蹲等。基于大熊猫的上述特点，本研究改变了现有训练仰躺B 超检查的思路，静等大熊猫表现出趴、犬坐、侧卧、靠坐、倦坐及半蹲等非仰躺体位，并在保证自身安全的前提下进行B 超检查，当大熊猫表现出不适或拒绝行为则结束B 超检查，待其恢复后再开展。通过研究最后发现B 超检查发现孕体的体位有趴、侧躺、犬坐、倦坐、靠坐和半蹲等，且孕体检查到的时间以及孕体的体长在非仰躺体位和仰躺体位之间相近，该发现突破了现有大熊猫孕体B 超检查局限于仰躺体位的限制。此外，妊娠后期大熊猫更愿意表达各种难度低的行为，非仰躺体位对母兽无应激反应且在实际中经常出现，大幅减少对减食后期母兽的体位要求，因此采用非仰躺体位为大熊猫孕体B 超检查的大规模推广提供了可能性。
本研究的探索结果改变了现有孕体B 超检查思路，由让大熊猫配合人完成特定动作开展B 超变为让人等待大熊猫自然放松而寻机进行B 超检查，极大地减少了对妊娠母兽的应激反应，更有利于孕体B超在大熊猫繁育中的大范围推广。
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