徐微微 阳柳思 徐婧 周有连 王红
【摘要】目的 明确海藻希瓦菌（S.algae）对小鼠结直肠腺瘤发生发展的影响及探讨其对免疫微环境的调控作用。方法 将24只小鼠分为3组：对照组、偶氮甲烷（AOM）/葡聚糖硫酸钠（DSS）组、AOM/DSS+S.algae组。比较各组小鼠的生存状态和结直肠腺瘤情况。取AOM/DSS组、AOM/DSS+S.algae组小鼠结直肠组织进行转录组测序，利用基因集富集分析和免疫浸润分析其免疫相关通路、免疫细胞和免疫因子的变化。结果 与AOM/DSS组相比，AOM/DSS+S.algae组小鼠体质量、存活率均下降，血便情况加重，生存状态较差、结直肠长度缩短（P均< 0.05），平均腺瘤数量及大小增多（P均< 0.05）。与AOM/DSS组相比，AOM/DSS+S.algae组炎症反应增强（P < 0.05），促炎细胞因子白介素（IL）-2、IL-6、IL-12、IL-17、干扰素、肿瘤坏死因子（P均< 0.05）和IL-1β的产生呈上升趋势，抑炎细胞因子IL-4、IL-10、IL-13（P均< 0.05）和转化生长因子β呈抑制趋势，初始B细胞和效应B细胞（P < 0.05）呈增多趋势，且激活小鼠体内核因子-κB（NF-κB）信号通路。结论 S.algae可能通过激活免疫信号（如活化B细胞和激活NF-κB通路），形成促肿瘤免疫微环境，进而促进结直肠腺瘤发展。
【关键词】海藻希瓦菌；
结直肠腺瘤；
免疫微环境；
NF-κB；
B细胞
Effect of Shewanella algae on the incidence and progression of colorectal adenoma and immune microenvironment in mice
XU Weiwei1， YANG Liusi1， XU Jing1， ZHOU Youlian2， WANG Hong1， 2
（1.School of Medicine， South China University of Technology， Guangzhou 510006， China；
2.Department of Gastroenterology， the Second Affiliated Hospital， School of Medicine， South China University of Technology， Guangzhou 510180， China）
Corresponding author：
WANG Hong， E-mail：
eywanghong@scut.edu.cn
【Abstract】Objective To investigate the effect of Shewanella algae （S.algae） on the occurrence and development of colorectal adenoma and its regulatory effect on the immune microenvironment in mice. Methods Twenty-four mice were divided into three groups：
control group， azoxymethane （AOM）/ dextran sodium sulfate （DSS） group， AOM/DSS+S.algae group. The survival status and colorectal adenoma of mice were compared among three groups. Colorectal tissues in the AOM/DSS group and AOM/DSS+
S.algae group were collected for high-throughput RNA-seq. Gene set enrichment analysis （GSEA）and cell-type identification by estimating relative subsets of RNA transcripts （CIBERSORT） were used to analyze the changes of immune-related pathways， immune cells and immune factors. Results Compared with the AOM/DSS group， the body weight （P < 0.05） and survival rate were decreased， the hematochezia was aggravated， the survival status was worsened，the colorectal length was shortened （all P < 0.05）， and the average number and size of adenomas were significantly increased （both P < 0.05） in the AOM/DSS+S.algae group. Compared with the AOM/DSS group， the inflammatory responses were significantly enhanced in AOM/DSS+S.algae group （P < 0.05）. The production of pro-inflammatory cytokines including interleukin （IL）-2， IL-6， IL-12， IL-17， interferon （IFN）， tumor necrosis factor （TNF） （all P < 0.05） and IL-1β showed an upward trend in the AOM/DSS+S.algae group， while the production of anti-inflammatory cytokines including IL-4， IL-10， IL-13 （all P < 0.05） and transforming growth factor β showed an inhibitory trend. Both naive B cells and plasma cells （both P < 0.05） were increased in AOM/DSS+S.algae group， and the nuclear factor -κB （NF-κB） signaling pathway was activated. Conclusion S.algae may form a tumor-promoting immune microenvironment by activating immune signals， such as activation of B cells and activation of the NF-κB pathway， and then promote the development of colorectal adenoma.
【Key words】 Shewanella algae；
Colorectal adenoma；
Immune microenvironment；
NF-κB；
B cell
结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是全球癌症相关死亡的第二大原因，在最新发布的全球癌症统计中，2022年全球估计有2 000万例新发病例和970万例癌症死亡。其中在2 000万例新发病例中CRC占9.6%（仅次于肺癌和女性乳腺癌），在970万例癌症死亡病例中CRC占9.3%（仅次于肺癌）［1］。在美国每年约有15万例CRC新发病例［2］，近年来，由于饮食及生活方式的改变，我国CRC发病率和病死率逐年上升，发病模式也逐渐接近发达国家［3］。结直肠腺瘤（colorectal adenoma， CRA）是由正常结直肠黏膜组织逐渐演变为异常增生（息肉、腺瘤），被公认为CRC癌前病变［4］。“腺瘤-癌”为大多数CRC的发生模式［5］。
肠道菌群失衡已被证实是与CRA形成及CRC 发生发展密切相关的重要因素［6-7］。课题组前期研究发现，作为CRC的早期事件，CRA患者亦存在肠菌失衡现象，进展期CRA患者肠道菌群结构显著区别于正常人和CRC患者［8-9］，其中，海藻希瓦菌（Shewanella algae，S.algae）的过度增殖与CRA形成和CRC发生发展呈正相关［10］，提示S.algae在CRA的发病机制中可能发挥关键作用。
S.algae的相关临床研究很少，对结直肠的作用不清楚，其真正临床意义尚未可知。本研究通过对结直肠腺瘤小鼠模型灌胃S.algae，明确S.algae在CRA发生发展中的作用及对肠道炎症微环境的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物
24只C57BL/6J小鼠（雄性；
8～9周龄；
体质量
20～24 g）均购买于斯贝福（北京）生物技术有限公司。所有程序均根据动物护理指导方案进行，并经华南理工大学医学院第二附属医院的动物伦理机构委员会批准（批件号：K-2021-139）。小鼠饲养在特定的无病原体条件下，并处于稳定的温度（22±2）℃和湿度（40%～70%）屏障系统中，具有12 h的光/暗循环，并提供食物和水。
1.2 实验方法
1.2.1 实验设计
将24只小鼠随机分为3组（每组n = 8）：对照组（Control）、偶氮甲烷（azoxymethane，AOM）/
葡聚糖硫酸钠（dextran sodium sulfate，DSS）组、AOM/DSS+S.algae组。除Control组外，其余小鼠于实验开始当日予AOM（10 mg/kg），方式为腹腔注射。休息1周，根据小鼠此时体质量重新分组。之后饮用2.5%的DSS 6 d后，改用正常饮用水（高压灭菌）2周［11］，AOM/DSS+S.algae组在饮用DSS 日开始每隔1 d灌胃S.algae（1×108 CFU/mL，
0.2 mL）1次，直至实验终点（28 d），对照组小鼠予等体积生理盐水灌胃。
1.2.2 细菌培养
S.algae购买于北纳生物，并在2216E培养基中生长，培养于37℃培养箱中。将对数生长期（OD600 nm=0.6～1.0）的细菌以5 000 r/min离心
10 min，PBS洗涤2次后，在细菌沉淀加入适量生理盐水至OD600 nm=1.0，此时重悬液中菌液的浓度约为1×108 CFU/mL，用于小鼠灌胃。
1.2.3 生存分数记录
每周测量小鼠体质量1～2次，根据表1进行生存评分并记录。
1.2.4 小鼠取材
第28日通过腹膜内注射戊巴比妥（50 mg/kg）麻醉实验小鼠进行肠组织和脾的取样。用预冷的1%牛血清白蛋白清洗肠道，测量肠道长度，称量大肠质量及脾质量。用剪刀沿长轴方向剖开肠腔，拍照记录腺瘤的有无、数量、生长位置和大小等。
1.2.5 RNA抽提和文库构建
采用TRIzol试剂依照说明书提取总RNA。使用 NanoDrop 2000分光光度计（Thermo Scientific， 美国）鉴定RNA纯度和定量，使用Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies，Santa Clara，CA，
美国）评估RNA完整性。使用VAHTS Universal V5 RNA-seq Library Prep试剂盒依照说明书构建转录组文库。转录组测序和分析由上海欧易生物技术有限公司（上海，中国）进行。
1.2.6 RNA测序和差异表达基因分析
采用Illumina Novaseq 6000测序平台对文库进行测序，并生成150 bp双端reads。采用fastp软件对fastq格式的raw reads进行处理，去除低质量reads后获得clean reads用于后续数据分析。使用HISAT2软件进行参考基因组比对，并进行基因表达量（fragments per kilobase million，FPKM）［12］计算，并通过HTSeq-count获得每个基因的reads 计数（counts）。使用基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）［13-14］软件进行基因集富集分析，使用预定义的基因集，将基因按照在2类样本中的差异表达程度排序，然后检验预先设定的基因集是否在这个排序表的顶端或者底端富集。
1.2.7 免疫浸润分析
CIBERSORT （cell-type identification by estimating
relative subsets of RNA transcripts）［15］是一种常用的免疫浸润分析方法，该方法基于已知参考数据集，默认提供22种免疫细胞亚型的基因表达特征集：LM22。
1.3 统计学处理
应用GraphPad Prism 9、Adobe Illustrator 2023进行分析与绘图。计量资料采用Shapiro-Wilk进行正态性检验，实验数据均符合正态分布，以表示，2组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 S.algae对结直肠腺瘤小鼠生存状态的影响
在AOM/DSS基础上对小鼠进行S.algae的灌胃，可以发现灌胃后，AOM/DSS+S.algae组体质量较AOM/DSS组有所下降，其中在第26日和第28日，AOM/DSS+S.algae与AOM/DSS组体质量有较大差异（P均< 0.01），在其他天数时，差异无统计学意义（图1A）。与AOM/DSS组相比，AOM/DSS+S.algae组精神状态明显较差、毛色不光泽，进食和饮水有下降，同时有严重的血便现象（图1B、C），对末次即第26日的生存分数进行分析，各单项指标的差异均无统计学意义，但AOM/DSS+S.algae组的生存总分低于AOM/DSS组的总分（P < 0.05，表2）。在实验终点结束前，AOM/DSS+S.algae组生存率有下降，而AOM/DSS组和野生对照组生存率都没有变化，未有小鼠死亡现象的发生（图1D）。
2.2 S.algae对小鼠结直肠腺瘤发生发展的影响
对各组小鼠结直肠段和脾取材测量观察，AOM/DSS+S.algae组和AOM/DSS组的脾质量和肠质量均高于Control组，差异均有统计学意义。AOM/DSS组和AOM/DSS+S.algae组的脾和肠质量差异虽无统计意义，但与AOM/DSS组相比，AOM/DSS+S.algae组的脾和肠质量显示出更重的趋势（表3）。而结直肠长度AOM/DSS+S.algae组和AOM/DSS组较Control组有所下降，其中AOM/DSS+S.algae组下降得更为明显（表3和图2A）。把肠道清洗后纵向剖开，肉眼观察到与AOM/DSS组相比，AOM/DSS+S.algae组腺瘤数量增多（P < 0.05，图2B、C），在肠道的上中下段都有分布而且体积也较大。与AOM/DSS组相比，AOM/DSS+
S.algae组直径大于2 mm的腺瘤数量较多（P < 0.001，图2D）。
2.3 S.algae促进小鼠体内炎症反应
用AOM/DSS+S.algae组和AOM/DSS组的小鼠结肠部分提取总RNA构建cDNA文库，通过高通量测序检测差异基因与变化的通路。对测序结果进行GSEA分析，结果显示，与AOM/DSS组相比，AOM/DSS+S.algae组中炎症反应通路活化程度更高（P < 0.001，图3A），此外还显示出AOM/DSS+
S.algae组B细胞的增殖较高（P = 0.004，图3B）。结果提示与AOM/DSS组相比，加入S.algae后，小鼠体内的炎症反应可能有所增强。
2.4 S.algae干预后小鼠体内免疫微环境的改变
利用CIBERSORT法评估小鼠结直肠腺瘤组织免疫浸润情况。CIBERSORT可通过不同免疫细胞中标志基因的差异表达分析出样品中各种免疫细胞的种类和分布，提供22种免疫细胞亚型的基因表达特征集。结果显示，初始B细胞、M0巨噬细胞、M1巨噬细胞、M2巨噬细胞、肥大细胞、自然杀伤（natural killer，NK）细胞和浆细胞（效应B细胞）占比较高（图4A）。AOM/DSS+S.algae组与AOM/DSS组初始B细胞比较差异虽无统计学意义，但AOM/DSS+S.algae组有增多的趋势（图4B）。与AOM/DSS组相比，AOM/DSS+S.algae组效应B细胞增多（P < 0.05，图4C）。与上述GSEA分析中显示AOM/DSS+S.algae组B细胞增殖较高的结果一致（图3B），推测加入S.algae后可能促进了B细胞的增殖。
进一步对免疫微环境中细胞因子分析，GSEA结果显示，与AOM/DSS组相比，AOM/DSS+S.algae
组中促炎细胞因子IL-1β、IL-2、IL-6、IL-12、IL-17、IFN和TNF的产生都呈上升趋势（图5A、B），而抑炎细胞因子IL-4、IL-10、IL-13和转化生长因子β（transforming growth factor β，TGF-β）呈现下降趋势（图5C）。同时也发现AOM/DSS+S.algae组中核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）活性上升和NF-κB 诱导激酶（NF-κB-inducing kinase，NIK）及Kappa B 抑制因子激酶（inhibitor of kappa B kinase，IKK）被激活（图5D），表明加入S.algae
后可能激活了小鼠体内NF-κB信号通路。S.algae可能通过细胞因子活化B细胞和激活NF-κB通路，形成促肿瘤免疫微环境，进而促进结直肠腺瘤发生发展。
3 讨 论
CRC的发病率和病死率在世界范围内呈上升趋势［16］，一直威胁着人群健康，给社会经济和患者家庭带来了沉重的负担［17］。CRC有多种病理类型，其中最常见的为腺癌［18］。CRA是公认的CRC癌前病变，大约85%的CRC是由CRA演变而来的［19］。
因此，深入了解CRA发生发展的过程，是实现CRC早期预防和早期治疗中亟待解决的关键问题，具有重要的临床意义。
人类结直肠定植了一种由微生物组成的共生群落，估计有1014个细菌，与哺乳动物细胞的总数近似［20］。一些细菌可能通过产生微生物基因毒素引入致癌突变［21］，而另一些细菌则产生干扰癌细胞核心代谢过程的代谢物［22］。此外，肠道内的细菌种类会改变局部和全身的细胞或代谢特征，从而影响治疗效果［23］。微生物群对肿瘤发生的广泛影响导致其成为癌症的标志物［24］。通过前期工作，我们发现与正常结直肠组织相比，S.algae在CRA中含量升高，S.algae在CRA发病中可能发挥关键作用。S.algae是一种革兰阴性菌，它的致病性现已确定，主要感染于体弱患者，可能与高病死率有关［25］。在临床中，S.algae经常与腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens， S.putrefaciens）相混淆，但似乎有越来越多的证据表明，在S.algae和S.putrefaciens之间，S.algae引起的人类疾病最多，此外对小鼠的致病性研究也表明，S.algae似乎是毒性更强的物种［26］。但S.algae一般是个案报道，相关研究较少，临床意义及致病机制不太清楚且与结直肠疾病的关系仍未知。本研究为探索S.algae对CRA发生发展的作用，我们在AOM/DSS组小鼠的基础上进行S.algae灌胃，结果显示与AOM/DSS组相比，AOM/DSS+S.algae组小鼠生存状态更差，血便和体质量下降都很严重，同时，结直肠长度缩短且显示出更多更大的腺瘤，因此S.algae加重了疾病，促进了CRA的发生、发展。
19世纪中期，Rudolf Virchow首先根据癌症起源于慢性炎症的部位，提出了炎症和癌症之间的相关性［27］。事实上，慢性、失调、持续和未解决的炎症与恶性肿瘤的风险增加以及大多数类型癌症的恶性进展相关［28-29］。从正常结肠上皮发展为结直肠癌需要一系列遗传和炎症免疫学因素来促成和塑造致瘤环境。结直肠癌发生过程中涉及的炎症特征包括炎症小体的激活［29］和 NF-κB 通路的激活［30］，这两者都可以通过对微生物刺激或细胞因子的反应而发生。在本研究中，我们发现对小鼠进行S.algae干预后，小鼠体内炎症与免疫反应明显增强，进一步分析发现AOM/DSS+S.algae组促炎因子IL-1β、IL-6、IL-17和TNF等的水平都呈现出高表达，抑炎细胞因子IL-4、IL-10和TGF-β水平显示出低表达。同时AOM/DSS+S.algae组中B细胞表现出更高的增殖和浸润占比。尽管迄今为止的免疫疗法研究主要集中在 T 细胞上，但越来越多的证据表明，肿瘤浸润性B细胞和浆细胞在肿瘤控制中具有至关重要的协同作用，在疾病的诊断和治疗中显示出很强的预测和预后意义［31］。此外我们还发现S.algae干预后，小鼠体内NF-κB通路明显被激活。NF-κB是一种多效性转录因子，在先天性和适应性免疫中起关键作用，是各种促炎因子表达所必需的［32］。除了在炎症中的关键功能外，NF-κB激活还可以通过增加细胞增殖和血管生成、抑制细胞死亡以及促进细胞侵袭和转移来支持癌变［33］。Greten等［34］研究表明，阻断肠上皮细胞中的NF-κB激活可显著降低CRC的发生率。结肠炎期间IL-6和TNF-α等细胞因子的释放可以促进肿瘤生长，而TGF-β和IL-10等免疫抑制细胞因子的低表达会加剧这一过程。
在健康的结肠组织中，即使是轻微的炎症，在结肠向发育不良结肠的转化中也起着重要作用。随着隐窝的发育异常，微生物群与固有层免疫细胞之间的屏障被破坏，进而促进细菌移位，最终使免疫原性微生物暴露于上皮细胞和抗原呈递细胞［35］。细菌刺激激活免疫信号通路导致体内平衡丧失，从而驱动促肿瘤炎症环境［36］。综上所述，在结直肠腺瘤发生发展过程中，S.algae可能通过激活免疫信号（如活化B细胞和激活NF-κB通路），形成促肿瘤免疫微环境，进而促进结直肠腺瘤的发生发展。
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（责任编辑：杨江瑜）