吴颖颖 文小玲 夏玉芳 于啸 娄艳辉
［摘要］ 目的
探讨miR-181c-5p对卵巢癌干细胞样细胞（OCS-LCs）肿瘤血管生成拟态（VM）的作用及其机制。
方法 采用无血清悬浮培养法将人卵巢癌细胞系OVCAR3细胞诱导形成OCS-LCs。将OVCAR3细胞分为A～C组，各组分别转染NC-miR-181c-5p、siRNA-miR-181c-5p和pRNA-miR-181c-5p。通过成球实验评估A～C组细胞成球能力。采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）方法检测A～C组细胞miR-181c-5p的相对表达量，采用Western blot实验检测A～C组细胞Oct-4、Nanog、HIF-1α和VEGF蛋白相对表达量。采用CCK-8实验检测A～C组细胞的活性，采用三维立体培养实验检测A～C组的血管形成率。
结果 OVCAR3细胞成功被诱导形成OCS-LCs。RT-qPCR实验结果显示，B组细胞的miR-181c-5p相对表达量显著低于A组，C组高于A组（t=2.25、8.68，P<0.05）。成球实验结果显示，B组与A组、A组与C组相比，细胞的成球周期显著缩短，最大的细胞球直径显著增大，成球率显著增加（t=5.56～33.66，P<0.05）。Western blot实验结果表明，B组与A组、A组与C组相比，Oct-4、Nanog、HIF-1α和VEGF蛋白相对表达量显著升高（t=4.51～56.15，P<0.05）。CCK-8实验结果显示，B组的细胞活性高于A组，C组低于A组（F=97.70～281.80，P<0.05）。三维立体培养实验结果显示，B组与A组、A组与C组相比较，血管形成率显著性提高（t=3.70、18.67，P<0.05）。
结论 miR-181c-5p可能通过降低细胞中HIF-1α和VEGF蛋白的表达，从而抑制OCS-LCs的VM形成。
［关键词］ 卵巢肿瘤；
肿瘤干细胞；
微RNAs；
缺氧诱导因子1，α亚基；
血管内皮生长因子类；
新生血管化，病理性；
体外培养技术
［中图分类号］ R737.31;R364.3 ［文献标志码］ A
肿瘤血管生成拟态（VM）是一种依赖于肿瘤细胞而非内皮细胞的肿瘤血管生成形式，能促进卵巢癌干细胞生长和转移[1-2]，缺氧诱导因子（HIF-1α）和血管内皮生长因子（VEGF）是VM形成的重要标志物[3]。研究发现miRNA在调控VM方面发挥着非常重要的作用，参与介导了肿瘤细胞中HIF-1α以及VEGF等多种血管生成因子的表达[4]。MiR-181属于miRNA中的一员，包括miR-181a-5p以及miR-181c-5p。课题组前期研究发现，miR-181a-5p在卵巢癌组织中的表达显著低于正常卵巢组织和输卵管组织，且具有抑制卵巢癌细胞迁移及侵袭的作用[5]。研究发现，miR-181家族中的另一重要成员miR-181c-5p，在卵巢癌组织中表达水平也低于正常卵巢组织[6]，但miR-181c-5p是否具有抑制卵巢癌干细胞样细胞（OCS-LCs）增殖的作用尚不清楚，其是否可以通过介导OCS-LCs中HIF-1α、VEGF的表达调节VM形成也未见相关报道。因此，本研究拟探究miR-181c-5p对OCS-LCs VM的作用及其机制，为卵巢癌的治疗寻找新靶点。
1 材料与方法
1.1 材料来源
人卵巢癌细胞系OVCAR3细胞（美国模式培养物集存库），胰岛素（美国Sigma公司），表皮细胞生长因子（EGF）、重组人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，美国Peprotech公司），小干扰RNA（上海吉玛制药技术有限公司），鼠抗人CD133（抗CD133-APC）流式抗体及同型鼠IgG抗体（美国Biolegend公司），兔源HIF-1α单克隆一抗（美国CST公司），Prime Script RT Reagent Kit试剂盒以及SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ试剂盒（日本TaKaRa公司），兔源GAPDH单克隆一抗（武汉赛维尔生物科技有限公司），兔源VEGF单克隆一抗、兔源Oct-4多克隆一抗、兔源Nanog多克隆一抗（武汉爱博泰克生物科技有限公司），辣根酶标记山羊抗兔IgG（H＋L）（北京中杉金桥生物技术有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 将OVCAR3细胞接种于含血清培养基（含体积分数0.01青霉素-链霉素双抗溶液和体积分数0.10胎牛血清的高糖DMEM培养基）中，置于37 ℃、含体积分数0.05的CO2培养箱中培养至合适密度后用于后续实验。
1.2.2 无血清悬浮培养法诱导OCS-LCs形成 将处于对数生长期的OVCAR3细胞，以1×106个/L密度接种于超低吸附6孔板中，用无血清培养基（含有DMEM/F12培养基、体积分数0.04 BSA、5 g/L胰岛素、0.02 g/L EGF、0.01 g/L bFGF）培养7～10 d，隔天换液一次，直至细胞生长成球形。当细胞球直径＞70 μm时，即为OCS-LCs。观察并记录OCS-LCs的成球周期、最大的细胞球直径和成球率。成球周期为自OVCAR3细胞开始培养至培养基中出现直径为70 μm的细胞球时的最短培养时间，成球率=直径＞70 μm的细胞球数量/接种的OVCAR3细胞数量×100%。
1.2.3 OCS-LCs鉴定 ①二次成球实验：取直径＞70 μm的细胞球，吹散成单细胞悬液以后，重新接种于超低吸附6孔板中，使用无血清培养基再培养7～14 d，观察是否可二次成球。②贴壁再分化实验：将吹散成单细胞的悬液培养于含血清培养基中，24 h后观察细胞贴壁情况。③流式分析技术检测细胞CD133阳性率：取处于对数生长期OVCAR3细胞和直径＞70 μm的细胞球，分别置于1.5 mL的EP管中，再向其内分别加入1 μg抗CD133-APC抗体，以IgG为同型对照，避光孵育30 min后，用流式细胞仪检测OVCAR3细胞和OCS-LCs的CD133阳性细胞数，并计算各自相应的CD133阳性率。
1.2.4 细胞的分组和处理 将处于对数生长期的OVCAR3细胞分为A～C组，分别转染NC-miR-181c-5p、siRNA-miR-181c-5p和pRNA-miR-181c-5p，于含血清培养基中培养24 h后，更换为无血清培养基继续培养21 d，隔天换液一次。
1.2.5 细胞成球实验 在无血清培养基中培养的21 d内，记录A～C组细胞的成球周期，测量各组最大的细胞球直径，并计算成球率，以此评估各组细胞的成球能力。
1.2.6 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测OCS-LCs中miR-181c-5p相对表达量 取培养21 d的各组细胞，用Trizol试剂提取细胞中总RNA，采用Prime Script RT Reagent Kit试剂盒以及SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ试剂盒，分别按照说明书进行反转录和扩增。引物序列分别为，U6-F：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，U6-R：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′，miR-181c-5p-F：5′-CGAACATTCAACGCTGTCG-3′，miR-1-81c-5p-R：5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′。以U6为内参，采用2－△△CT法计算各组细胞当中miR-181c-5p相对表达量。
1.2.7 蛋白质印迹实验（Western blot）检测OCS-LCs中Oct-4、Nanog、HIF-1α和VEGF蛋白相对表达量 取培养21 d的各组细胞，用RIPA裂解液充分裂解细胞。加入5×loading buffer煮沸后变性处理，BCA法检测蛋白浓度。使用PAGE凝胶快速制备试剂盒制备SDS-PAGE凝胶，在凝胶小孔中加入10～20 μL各组细胞提取的蛋白样品。调节电泳仪，先用80 V电泳30 min以后更改为110 V恒压60 min分离细胞裂解物，280 mA转膜90 min，将蛋白转移到PVDF膜上，一抗4 ℃下孵育过夜。加入辣根酶标记的山羊抗兔IgG二抗，室温下缓慢摇动孵育2 h。最后使用化学发光增强剂进行免疫印迹显色，在显影仪下拍照，并使用Image J软件对条带进行量化分析，计算Oct-4、Nanog、HIF-1α以及VEGF蛋白的相对表达量。
1.2.8 CCK-8实验检测OCS-LCs的细胞活性 取A～C组处于对数生长期的细胞，稀释成细胞密度为1×107个/L的细胞悬液，按1 000个/孔分别接种于96孔板。各组分别在培养第24、48、72、96小时时，加入CCK-8试剂，然后避光孵育2 h，使用酶标仪于450 nm波长处检测各组细胞吸光度值，并计算细胞活性。
1.2.9 三维立体培养实验检测OCS-LCs的血管形成率 将Matrigel基质胶与DMEM混合液（1∶1）200 μL混合后均匀铺于提前预冷的24孔板上，于培养箱中放置45 min，以促进凝固。取A～C组处于对数生长期细胞，稀释成细胞密度1×108个/L的细胞悬液，按照每孔1×104个细胞的数量分别接种于24孔板当中。每隔2 h用倒置相差显微镜观察VM的形成情况，并拍照，同时记录血管形成数，计算血管形成率。血管形成率=血管形成数/接种细胞数×100%。
1.3 统计学处理
采用SPSS 26软件对数据进行统计分析。计量资料以[AKx-D]±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验；
多组不同时间点的比较采用重复测量设计方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 OCS-LCs形成和鉴定结果
在将OVCAR3细胞诱导形成OCS-LCs过程中，4～7 d时OVCAR3细胞聚集形成细胞球，形态呈圆形串珠样，8～10 d后细胞球持续增大，形状逐渐呈规则球形，密度更加紧密。二次成球实验显示，单细胞悬液在无血清培养基中继续培养时，能再次聚集形成细胞球，并克隆生长（图1A）。在贴壁再分化实验中，培养于含血清培养基中的单细胞悬液，培养24 h后可重新分化，并可贴壁生长（图1B）。流式分析技术检测结果显示，OCS-LCs和OVCAR3细胞的CD133阳性率分别为（18.00±1.60）%、（7.10±1.10）%，两者比较差异有显著性（t=14.20，P<0.05）。
2.2 MiR-181c-5p RNA对OCS-LCs成球能力的影响
A～C组细胞在无血清培养基中均能够继续成球生长，成球周期分别为（13.00±0.58）、（8.30±0.33）、（17.00±0.58）d；
最大的细胞球直径平均值分别为（121.00±4.04）、（172.00±4.41）、（78.30±3.84）μm；
成球率分别为（3.13±0.18）%、（9.03±0.19）%、（1.38±0.11）%。各组间上述三项指标比较差异均有显著性（F=72.57～621.90，P<0.05），同时各组间两两比较，上述三项指标也均差异有显著性（t=5.56～33.66，P<0.05）。
2.3 MiR-181c-5p对OCS-LCs中Oct-4、Nanog、HIF-1α和VEGF表达的影响
RT-qPCR检测结果显示，A～C组的细胞内miR-181c-5p相对表达量依次为1.01±0.14、0.24±0.06、3.20±0.71，各组之间整体上比较差异具有显著性（F=40.61，P<0.05），各组之间两两比较也均差异具有显著性（t=2.25～8.68，P<0.05）。Western blot实验的结果显示，各组之间细胞内Oct-4、Nanog、HIF-1α以及VEGF蛋白相对表达量比较差异具有显著性（F=89.54～1 597.00，P<0.05），各组之间两两比较上述4个蛋白相对表达量差异也均具有显著意义（t=4.51～56.15，P<0.05）。见表1、图2。
2.4 MiR-181c-5p对OCS-LCs的细胞活性和血管形成率的影响
CCK-8实验检测结果显示，时间、分组和时间与分组的交互作用对细胞活性均具有显著性影响（F时间=553.80，F组别=543.30，F交互=38.57，P<0.05）；
单独效应结果显示，随培养时间延长，每组细胞的细胞活性均逐渐增高，差异有显著性（F组内=118.80～281.80，P<0.05），在培养第24、48、72和96小时时，各组间两两比较，细胞活性均差异有显著性（F组间=97.70～211.10，P<0.05）。见表2。三维立体培养实验检测结果显示，A～C组细胞的血管形成率依次为（100.00±13.48）%、（385.30±35.66）%、（29.41±13.48）%，各组比较差异具有显著性（F=195.40，P<0.05），同时各组间两两比较也均差异具有显著性（t=3.70～18.67，P<0.05）。见图3。
3 讨 论
肿瘤干细胞（CSCs）是一类具有自我更新和多向分化能力的异质性细胞，能促进肿瘤细胞的转移，增加肿瘤细胞的化疗抗性，参与肿瘤的发展、转移和复发[7-8]。研究认为OCS-LCs增加了卵巢癌浸润和转移的风险，同时也是导致癌症复发和化疗耐药的原因之一[8]。因此，深入研究OCS-LCs的发生发展机制，寻找卵巢癌治疗的新靶点是目前卵巢癌临床治疗的研究热点之一。本研究首先对诱导形成的悬浮细胞球进行验证，结果显示，将细胞球重悬成单细胞后，在无血清培养基中可再次聚集成细胞球，在含血清培养基中则可以重新分化，并能够贴壁生长。CD133是一种糖基化膜蛋白，是目前比较公认的OCS-LCs表面标志物之一，本研究的流式分析技术检测结果显示，OCS-LCs的CD133阳性率明显高于OVCAR3细胞。以上三种验证方法均表明，本研究成功诱导形成了OCS-LCs。
MiRNA能调节CSCs的发生发展[9]。研究发现，在乳腺癌干细胞中，上调miR-526b-3p表达能抑制乳腺癌干细胞形成；
用上调miR-526b-3p的乳腺癌干细胞构建裸鼠移植瘤模型，发现裸鼠的移植瘤体积缩小、质量减轻，说明移植瘤生长被抑制[10]。YU等[11]发现在骨髓间充质干细胞BMSCs中，上调miR-181c-5p能抑制SFRP1/Wnt/β-catenin通路，促进干细胞分化成破骨细胞。本研究结果显示，B组与A组、A组与C组相比，细胞内miR-181c-5p相对表达量显著减少，提示小干扰RNA转染成功。成球实验结果显示，与A组细胞相比，B组细胞的成球周期缩短、最大的细胞球直径增大、成球率提高，C组细胞的成球周期延长、最大的细胞球直径减小、成球率降低。Oct-4、Nanog是CSCs的转录因子，是识别CSCs的生物标志物[12]。本研究结果显示，B组细胞的Oct-4、Nanog蛋白的相对表达量高于A组，C组细胞的Oct-4、Nanog的蛋白相对表达量低于A组。上述结果提示miR-181c-5p可降低OVCAR3细胞的成球能力，抑制OCS-LCs的形成。研究发现，在肺腺癌H460细胞中，上调miR-181c-5p能提高细胞活性，促进肿瘤细胞增殖[13]；
上调宫颈鳞状细胞癌SiHa细胞内miR-181c-5p表达后，细胞增殖受到显著抑制[14]。本研究结果显示，A～C组细胞的细胞活性随培养时间延长而逐渐增高；
在培养第24、48、72和96小时时，B组细胞的细胞活性均高于A组，C组细胞的细胞活性低于A组，提示miR-181c-5p可抑制OCS-LCs的增殖。
VM是肿瘤血管生成形式之一，通过肿瘤细胞变形和细胞外基质相互作用等方式模拟内皮细胞，环绕形成管腔[15]。YI等[16]研究发现，在体外模型和裸鼠移植瘤模型中，高水平的miR-374b-5p可抑制神经胶质瘤细胞增殖、迁移、侵袭和VM的形成；
上调miR-181c-5p表达可通过调节骨髓源性内皮祖细胞的血管生成，促进VM形成[11]，均提示miRNA参与了调控肿瘤VM的形成。本研究三维立体培养实验结果显示，与A组相比，B组的血管形成率显著提高，C组的血管形成率显著降低。HIF-1α和VEGF是影响VM形成的重要因子，其在肿瘤组织中的表达水平增高通常意味着VM形成增多[17-18]。由于肿瘤细胞生长迅速，肿瘤内部血供不足，导致肿瘤细胞缺氧。当肿瘤细胞缺氧时，细胞中HIF-1α含量会明显增高，进而促进上皮-间质转化和VM形成[19]，因此可以通过降低肿瘤细胞中HIF-1α的水平来抑制VM形成，延缓肿瘤进展[20]，如Hsp90抑制剂AT-533就是通过阻断HIF-1α/VEGF/VEGFR-2通路，抑制了乳腺癌细胞的生长和VM的形成[21]。VEGF是一种与肿瘤进展和预后密切相关的血管生成启动子。而通过降低卵巢癌细胞中的VEGF水平是卵巢癌治疗的重要手段之一，具有良好的应用前景[22]。最新研究发现，贝伐珠单抗能改善低表达VEGF-A165b（一种抗血管生成VEGF-A剪接变异体）的晚期卵巢癌患者的预后，而对高表达VEGF-A165b的晚期卵巢癌患者的预后没有影响，这对指导晚期卵巢癌患者的治疗决策具有重要临床意义[23]。本研究结果显示，B组与A组、A组与C组相比，OCS-LCs中HIF-1α和VEGF蛋白相对表达量增加，提示miR-181c-5p对OCS-LCs的VM形成具有抑制作用，可能是通过下调HIF-1α以及VEGF的表达实现的，但具体机制仍有待深入探究。
综上所述，本研究成功诱导形成了OCS-LCs，上调OCS-LCs内的miR-181c-5p表达，可显著抑制其增殖和VM的形成，其机制可能是miR-181c-5p降低了细胞内Oct-4、Nanog、HIF-1α和VEGF的蛋白水平。这为寻找卵巢癌的抗血管治疗的新靶点提供了理论支持。
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