聂雅琴 乌日娜 金慧 张广平 李永明 智利 薛仕煊 娜日格乐
心肌纤维化是多种心脏疾病、进展的重要环节，心肌细胞代谢异常、心肌肥厚、冠状动脉硬化等因素均可导致心脏受损，引起心肌纤维化，造成心脏功能障碍，甚至威胁生命。心肌纤维化主要表现为心肌中胶原纤维过度沉积，胶原浓度和体积分数显著升高，胶原类型不均衡及排列紊乱[1]。心肌纤维化参与各种心血管疾病的发生、进展过程，如充血性心力衰竭、高血压性心脏病、心肌梗死、扩张型心肌病等。此外，在代谢性疾病中也可见到不同程度的心肌纤维化[2]。研究表明，自噬与心肌纤维化密切相关。自噬是溶酶体降解蛋白质的高度保守过程，对机体的生存、分化、发育和稳态至关重要[3]。高迁移率族蛋白1（HMGB1）为高度保守的核蛋白，广泛分布于哺乳动物细胞中且含量丰富，平均10～15个核小体中含有1个HMGB1分子[4]。HMGB1可促进促炎症因子产生，参与细胞增殖、分化、侵袭和自噬等过程[5]。本研究探讨HMGB1通过调控自噬对心肌纤维化产生作用，以期为心肌纤维化的预防及临床诊治提供新方法。
1.1 实验材料
人心肌细胞AC16购于同派生物科技股份有限公司细胞库。α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体、Ⅰ型胶原蛋白（CollagenⅠ）抗体购于英国Abcam公司。HMGB1、微管相关蛋白1轻链3（LC3）-Ⅱ/LC3-Ⅰ、P62抗体、磷酸肌醇-3-激酶3（PIK3C3）抗体购于美国Sigma公司。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、磷酸化mTOR（p-mTOR）抗体购于美国Cell Signaling Technology公司。
1.2 细胞培养
AC16细胞使用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的DMEM培养基（完全培养液）培养，置于37 ℃、5%CO2恒温培养箱中，湿度为70%～80%。取生长良好的对数生长期细胞用于实验。
1.3 免疫荧光染色检测AC16细胞α-SMA的表达水平
将AC16细胞接种于12孔板上，待细胞贴壁后，加入不同浓度的HMGB1（0、4、20、100 μg/L），继续培养6 h。每孔加入4%多聚甲醛室温固定10 min后，加入0.5% Triton X-100室温静置10 min。3%牛血清蛋白封闭1 h后，加入α-SMA一抗（稀释比例1︰100），4 ℃孵育过夜，加入山羊抗兔IgG二抗（稀释比例1︰200），避光室温孵育1 h。4’6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）封片后置于激光共聚焦显微镜下观察并拍照。
1.4 Western blot法检测AC16细胞自噬信号通路蛋白及纤维化因子表达水平
取AC16细胞，RIPA裂解液提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取蛋白进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，PVDF转膜，加入LC3、P62、α-SMA、CollagenⅠ、p-mTOR、mTOR一抗，4 ℃孵育过夜，加入羊抗兔IgG二抗，室温孵育2 h。ECL显影，采用Gel-Pro3.0软件分析蛋白的相对表达水平。
1.5 免疫共沉淀法检测P62与α-SMA的作用关系
将细胞培养皿中的培养基丢弃，加入Co-IP裂解液，4 ℃、10 000×g离心30 min，取上清液。按说明书进行操作，将变性后的Input和IP液进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用免疫共沉淀法检测P62与α-SMA之间是否存在相互作用。
1.6 统计学分析
应用SPSS 20.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t法。P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 各组AC16细胞中CollagenⅠ和α-SMA的表达水平比较
Western blot检测显示，用不同浓度的HMGB1刺激AC16细胞，AC16细胞中CollagenⅠ与α-SMA的蛋白表达水平呈浓度依赖性升高。组间两两比较显示，各组间CollagenⅠ与α-SMA的蛋白表达水平的差异均有统计学意义（P均＜0.01）。见表1、图1。
图1 不同浓度HMGB1作用于AC16细胞后CollageⅠ和α-SMA蛋白表达情况
表1 不同浓度HMGB1作用于AC16细胞后Collagen Ⅰ和α-SMA的蛋白表达水平比较
免疫荧光染色显示，HMGB1（100 μg/L）作用于AC16细胞后，α-SMA的表达水平升高。见图2。
图2 免疫荧光染色检测100 μg/L HMGB1作用于AC16细胞后α-SMA的蛋白表达情况
2.2 各组AC16细胞中自噬相关蛋白的表达水平比较
Western blot检测显示，用不同浓度的HMGB1刺激AC16细胞，AC16细胞p-mTOR与mTOR的比值（p-mTOR/mTOR），PIK3C3、不可溶性P62的蛋白表达水平，LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ的比值（LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ)呈浓度依赖性升高，可溶性P62的蛋白表达水平呈浓度依赖性降低。组间两两比较显示，各组间p-mTOR/mTOR，PIK3C3、不可溶性P62的蛋白表达水平，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的差异均有统计学意义（P均＜0.01）。见表2、图3。
图3 不同浓度HMGB1作用于AC16细胞后自噬相关蛋白的表达情况
表2 不同浓度HMGB1作用于AC16细胞后自噬相关蛋白的表达水平比较
2.3 P62与α-SMA的关系
免疫共沉淀实验显示，P62与α-SMA存在相互作用。见图4。
图4 AC16细胞中p62与α-SMA的相互作用
心肌纤维化是以细胞外基质（ECM）成纤维细胞异常增殖，胶原过度沉积及异常分布为特征的病理现象。急性心肌缺血及慢性心脏疾病均可导致心脏压力负荷增加，进而促进心肌纤维化的进展[6]。心脏成纤维细胞（CFB）在心肌纤维化中起重要作用。当机体处于稳态时，CFB通过调节ECM的产生维持心脏结构的完整性。在病理条件下，CFB激活、增殖，并分泌过量的ECM蛋白，导致心肌纤维化，引起心律失常、心脏室壁运动减低及心脏重构[7-8]。延缓心肌纤维化有助于改善心血管疾病的预后[9-11]，但目前尚无有效预防及治疗方案。
HMGB1为高度保守的核蛋白，在感染或无菌炎症时可从细胞中释放。研究显示，心肌纤维细胞在高糖高脂（HGHL）干预后，HMGB1的表达水平显著增加，提示HMGB1参与HGHL促心脏纤维化过程[12]。张妍等[13]研究发现，阻断HMGB1可减轻大鼠心肌梗死导致的纤维化。在急性血吸虫病导致的肝纤维化中，抑制HMGB1可显著降低肝纤维化水平[14]。上述研究提示，抑制HMGB1可能是治疗组织纤维化的有效途径。为了明确HMGB1对心肌纤维化的作用，我们前期研究用不同浓度HMGB1作用于小鼠原代心肌成纤维细胞，发现HMGB1导致的CollagenⅠ和α-SMA表达水平升高呈浓度依赖性[15]。基于此结果，本研究用不同浓度的外源性HMGB1作用于AC16细胞，结果提示随着外源性HMGB1浓度的增加，AC16细胞中心肌纤维化标志蛋白CollagenⅠ和α-SMA表达水平逐渐升高。
有研究发现，改变自噬水平可以改善心肌纤维化[16]。自噬见于多种心血管疾病，如心肌慢性缺血、心肌纤维化、心脏重构等。自噬可抑制细胞凋亡，减轻组织损伤[17]，但过度自噬则导致细胞死亡。因此，只有当自噬活性保持在最佳平衡水平时，才可以保持正常的心血管功能[18]。P62为致癌蛋白，定位于细胞核，当细胞发生自噬时，细胞质中的P62与泛素化蛋白结合，随后与自噬小体内膜上的LC3-Ⅱ蛋白结合形成复合物，并在自噬溶酶体中降解[19]。当自噬受到抑制时，P62的表达水平会明显增加[20]，所以P62蛋白是自噬发生的重要标志蛋白。在自噬发生时，胞浆型LC3即LC3-Ⅰ会酶解掉一小段多肽，转变为膜型LC3即LC3-Ⅱ，因此，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ可反映自噬水平的高低。为了评估自噬在AC16细胞纤维化中的作用，本研究检测AC16细胞中自噬标志性蛋白的表达水平，结果显示LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ增大，提示自噬被激活，LC3-Ⅱ的增加可能是由于自噬溶酶体降解过程受阻。同时，p-mTOR/mTOR、PIK3C3的表达水平显著增加，提示自噬受抑制；
可溶性P62的表达水平降低，不可溶性P62的表达水平升高，无论LC3是否发生由Ⅰ型向Ⅱ型的转化，均代表自噬流受到抑制。以上实验结果表明，在高浓度HMGB1作用下，即使AC16细胞中存在更多的LC3-Ⅱ，细胞内的自噬流依然受到抑制。
HMGB1可在不同生理条件下从细胞中释放，参与调节心肌细胞自噬及心肌纤维化[21-22]。Du等[23]研究发现阿霉素可通过促进HMGB1表达，使心肌细胞自噬和凋亡增加，引起心脏损伤。Hu等[24]发现，心肌细胞在缺氧/复氧时，会出现自噬活性的改变，这可能与HMGB1的释放有关。本课题组前期通过免疫荧光共定位和免疫共沉淀实验发现，在HMGB1的作用下，小鼠原代心肌成纤维细胞内α-SMA与P62之间存在相互作用。本研究通过免疫共沉淀实验验证，AC16细胞中内源性的P62与α-SMA之间存在相互作用，可能导致α-SMA在细胞内堆积，并引起自噬流受阻。
本研究证实，外源性HMGB1可抑制AC16细胞中的自噬流，诱导AC16细胞纤维化。抑制HMGB1对心肌细胞的作用，有望成为预防与治疗心肌纤维化的新方法。
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