李雯霏，韩 硕，岑淑敏，樊露双
（桂林理工大学南宁分校，广西 南宁 532100）
澳洲坚果又名昆士兰栗、夏威夷果，为多年生常绿乔木，我国主要分布于广西、云南等亚热带地区[1-2]。研究发现澳洲坚果果壳中含有多糖、黄酮等活性物质，具有抗氧化等功效。但澳洲坚果果壳多被丢弃，造成了资源浪费。多糖具有抗氧化、抗肿瘤、免疫增强、抑菌性、辅助降血糖、乳化、延缓人体衰老等多种生物活性[3-4]。多糖提取常采用溶剂、酶、微波辅助、超声波辅助以及超临界流体抽提等方式[5-11]，其中溶剂水提法是最传统的提取方法，操作简单、成本低，不会对活性物质造成伤害，可以最大限度地保留物质本身性质，因此被广泛应用。本研究以澳洲坚果果壳的多糖得率为考核指标，通过正交实验探索多糖的最佳提取条件，旨在为澳洲坚果多元化产品开发提供参考。
1.1 主要材料与试剂
澳洲坚果果壳，葡萄糖标准品(纯度99.5%)，石油醚、苯酚等为分析纯。
1.2 主要设备与仪器
UV-1800PC 紫外可见分光光度计，JP-1000 B型高速多功能粉碎机，HG101-2A 型电热鼓风干燥箱。
1.3 实验方法
1.3.1 原料预处理
将澳洲坚果果壳洗净，放入电热鼓风干燥箱中，60℃下烘2h。取出冷却至室温，用粉碎机粉碎成干细粉末，过0.25mm筛。将得到的细粉加入烧杯中，倒入8 倍量的石油醚，用玻璃棒搅拌数次，使其均匀反应，于通风橱中静置沉降5～6h。小心倒出上层石油醚，待烧杯内的果壳粉表面的石油醚挥发后，在通风橱内挥干样品，得到脱脂后的澳洲坚果果壳粉。
1.3.2 葡萄糖标准曲线的绘制
采用苯酚-硫酸法[12]进行标准曲线的测定。配制质量浓度为1.00mg·mL-1的葡萄糖标准溶液，在UV-1800 紫外分光光度计上，测定波长490nm 处的吸光度。以葡萄糖标准溶液的质量浓度为纵坐标，吸光度值为横坐标，绘制标准曲线，计算标准曲线的线性回归方程。
1.3.3 样品多糖的提取及得率计算
水浴锅预热温度设定为70℃，准确称取1.00g脱脂后的澳洲坚果果壳粉于250mL 圆底烧瓶中，加入50mL 纯化水，摇匀，回流、水浴加热3h。冷却至室温，抽滤、浓缩，取滤液，转移至250mL 容量瓶中，用纯化水定容至刻度。用移液管精确吸取2.00mL 定容后的提取液于25mL 比色管中，按照标准曲线的绘制方法测定提取液的吸光度，进行3组平行测定，取平均值。提取率按式(1)进行计算：
式中，C为多糖的质量浓度，mg·mL-1；
N为溶液稀释倍数；
V1为提取液的定容体积，mL；
V2为澳洲坚果果壳粉末的质量，g。
1.3.4 单因素实验
本实验有3 个影响因素，即提取时间、提取温度、提取料液比。采用单因素实验，研究各因素对澳洲坚果果壳多糖提取率的影响，因素及水平表见表1。
表1 单因素实验及水平表
1.3.5 正交实验
根据单因素实验结果，选择提取时间(A)、提取温度(B)、料液比(C)等3 个因素，采用L9(34)正交表进行实验。
2.1 葡萄糖的标准曲线
采用苯酚-硫酸法测定葡萄糖标准溶液的质量浓度C与吸光度A的关系，所得标准曲线见图1。计算得到的葡萄糖标准曲线的线性回归方程为：C=90.211A-0.8765，相关系数R2=0.9989。
图1 葡萄糖的标准曲线
2.2 提取时间对澳洲坚果果壳多糖提取率的影响
图2是提取时间对澳洲坚果果壳多糖提取率的影响。从图2 可知，在2.5～3.0h 范围内，随着提取时间延长，澳洲坚果果壳的多糖提取率逐渐增大，3.0～3.5h 时，多糖提取率先短暂下降之后达最大值4.76%。之后随着提取时间延长，多糖提取率呈下降趋势。出现下降的原因可能是长时间作用导致杂质溶出，或是随时间延长，多糖的分解程度增大。由此选定多糖提取率迅速增加的时间点3.5h、4.0h、4.5h进行正交实验。
图2 提取时间对澳洲坚果果壳多糖提取率的影响
2.3 提取温度对澳洲坚果果壳多糖提取率的影响
保持料液比为1∶50（w/v），水浴提取时间为3h，在40～90℃范围内，考察水浴回流提取温度对澳洲坚果果壳多糖提取效果的影响，结果见图3。由图3可知，随着提取温度升高，澳洲坚果果壳的多糖提取率逐渐增大，80～90℃时多糖提取率增长迅速，超过90℃后，温度过高会影响多糖的生物活性，因此选择70℃、80℃、90℃进行正交实验。
图3 提取温度对澳洲坚果果壳多糖提取率的影响
2.4 提取料液比对澳洲坚果果壳多糖提取率的影响
保持提取时间为3h，水浴提取温度为70℃，在1∶10～1∶60 的提取料液比范围内，考察提取料液比对澳洲坚果果壳多糖提取效果的影响，结果见图4。由图4可知，随提取料液比增大，澳洲坚果果壳的多糖提取率逐渐增大，但料液比持续增大，多糖提取率逐渐趋于平缓。考虑到固液比的差距过大可能会导致后续实验出现浪费，增加成本，因此选择1∶40、1∶50、1∶60进行正交实验。
图4 提取料液比对澳洲坚果果壳多糖提取率的影响
2.5 正交实验结果与分析
表2是正交实验结果。由表2可知，极差数据R(B)＞R(A)＞R(C)，说明在3 个影响因素中，提取温度对澳洲坚果果壳多糖提取率的影响最大，提取时间次之，料液比的影响最小。从正交实验得出的最佳实验条件为：提取时间4h，提取温度90℃，提取料液比1∶60。但从表2 可知，因素C 中，料液比1∶40 和1∶60 的K值差别不大，且料液比的影响小，说明这2个条件的提取效果差别不大。分别按料液比1∶40和1∶60，提取温度90℃，提取时间4h进行平行实验，得到了相同结果。考虑到较低的料液比可以节约成本，因此确定最优的提取工艺参数为4h、90℃、1∶40，此时澳洲坚果果壳多糖的提取率为5.35%。
表2 正交实验结果
本文以澳洲坚果果壳为原料，纯化水为溶剂，采用水浴加热回流的方法提取澳洲坚果果壳中的多糖，用苯酚-硫酸法测定了提取液中的多糖含量。结论如下：
1）单因素实验结果表明，澳洲坚果果壳多糖的提取率随提取时间的延长而提高，4.5h时达到最高。提取温度升高后，澳洲坚果果壳的多糖提取率也相应增加。提高提取料液比，澳洲坚果果壳的多糖提取率也逐渐提高。
2）正交实验结果表明，多糖的提取过程中，提取温度对澳洲坚果果壳多糖提取率的影响最大，提取时间次之，料液比的影响最小。最优的提取工艺参数为：提取时间4h，提取温度90℃，料液比1∶40。此时澳洲坚果果壳多糖的提取率达5.35%。
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