龙小玲,卜昆鹏,曹 昭,黄军强,马彩芳,卢秋龙,曾 焕,张 云,舒 宏*
(1.广西医科大学附属肿瘤医院,广西 南宁530021;2.广西医科大学第一附属医院,广西 南宁530021)
肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)作为世界上第六大最常见的恶性肿瘤,全球死亡率在所有类型的癌症中排名第二,且每年在全球新增的病例超过90万[1-4]。在中国,HCC的发生很大程度与肝脏炎症关系密切[5]。慢性肝脏炎症会导致氧化/亚硝化应激和脂质过氧化,产生过量的活性氧和活性氮及醛类。作为对氧磷酶基因家族的一员,对氧磷酶1(paraoxonase 1,PON1)是一种在脂质代谢中起关键作用的酶,主要负责抗氧化防御[6]。已有研究表明,PON1基因或蛋白活性的改变,与肝细胞癌[7]、卵巢癌[8]、膀胱癌[9]以及肺癌[10]等多种疾病相关。本研究通过检测90对肝癌及癌旁组织样本中PON1 mRNA表达水平,并回顾性分析临床病理资料及预后随访信息,以及在线数据库数据,旨在评估PON1在HCC组织中的表达及其对临床预后的意义,报道如下。
1.1 TIMER数据库
TIMER2.0数据库包括TCGA数据库的32种癌症类型的10 897个样本(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)[11]。通过在线数据库,分析PON1在多种肿瘤组织中的表达差异。
1.2 HCCDB数据库
利用HCCDB数据库分析PON1在肝癌和癌旁组织中的表达量,该数据库包含来自GEO和TCGA的3 917个肝癌组织样本 (http://lifeome.net/database/hccdb/home.html)[12]。
1.3 组织样本
收集2011年4月至2015年6月在广西医科大学附属肿瘤医院手术的90例原发性肝癌患者(24～72岁)的癌组织及癌旁非癌肝组织(距离肿瘤边缘>5 cm),并回顾性分析对应临床病理资料及随访信息。纳入标准:患者接受手术切除的治疗方式,且组织病理学诊断为原发性HCC。排除标准:合并其他肿瘤组织和随访失败的患者。标本的使用经医院伦理委员会批准。
1.4 RT-qPCR
采用Trizol试剂(美国Invitrogen)提取肝癌与癌旁组织总RNA,PON1和内参GAPDH引物由上海生工生物工程股份有限公司合成,引物序列见表1,采用TaKaRa 公司的RT-qPCR 试剂。根据2-ΔΔCT方法计算PON1的mRNA表达水平,以中位数为界,将90例肝癌组织样本分为高表达组(n=45)和低表达组(n=45),进行肝癌的预后分析。
表1 引物序列
1.5 Kaplan-Meier plotter
采用Kaplan-Meier plotter数据库(http://kmplot.com/analysis/),对基于TCGA数据库的369例HCC样本分为高、低表达组,进行预后分析[13]。
1.6 COX回归分析及预后列线图的构建和验证
通过单因素和多因素Cox回归分析,确定PON1与临床病理特征的相关性和对肝癌患者预测的独立预后影响。选择P值具有统计学意义的参数,预测HCC的1、2、3年生存的概率,采用R软件的“survival”、“ggplot2”和“rms”包,构建肝癌患者的预后列线图,并通过绘制1、2、3年生存率的校准曲线,以验证模型预测能力的一致性。
1.7 PON1与免疫细胞浸润的相关性分析
为了评估HCC中PON1的表达与免疫细胞浸润之间的相关性,使用包含24种免疫细胞群丰度的“ssGSEA”算法分析免疫浸润特征[14-15]。此外,采用了R软件的“GSVA”、“ggplot”包,分析PON1高、低表达组间免疫细胞浸润水平的差异。
1.8 统计学分析
应用SPSS 26.0、R 4.3.2对所收集数据进行统计学分析。非正态分布的数值资料以中位数(四分位数间距)表示。组间差异采用配对Mann-WhitneyU检验,相关性分析采用spearman相关性分析。采用Kaplan-Meier法计算生存率,GraphPad Prism 9.5.1软件绘制生存曲线。单因素生存分析采用Log-rank检验,多因素生存分析采用Cox比例风险模型。P<0.05表示差异具有统计学意义。
2.1 PON1在HCC及其他肿瘤中的mRNA表达水平
图1A所示,TIMER数据库中不同类型的肿瘤之间存在明显的异质性。比较TIMER数据库中HCC和对应的癌旁组织,PON1 mRNA在HCC中表达水平显著低于癌旁组织。分析HCCDB数据库中的10个数据集发现,PON1在HCC组织中的表达水平也显著低于癌旁组织(图1B)。qRT-PCR结果证实,与癌旁组织相比,90例肝癌组织中PON1的mRNA水平显著下调(图1C,P<0.001)。
图1 PON1 在HCC中的mRNA表达水平 (A.TIMER数据库中人PON1在不同肿瘤及癌旁正常组织中的表达水平;B.HCCDB数据库中人PON1在HCC和癌旁正常组织中的表达水平;C.PON1在90对HCC及癌旁正常肝组织中的mRNA表达水平)
2.2 PON1 mRNA在HCC中表达水平与临床病理参数的预后价值
Kaplan-Meier生存分析结果显示,在PON1低表达的HCC患者中,总生存期显著降低(图2A,P<0.001)。同样,在90对临床组织样本中,PON1表达水平越低,HCC患者的总生存期也显著降低(HR=2.019;95%CI:1.041～3.916;P=0.038),表明PON1可能是一个潜在的HCC预后标志物(图2B,P<0.05)。结合临床病理参数的预后分析,发现BCLC分期、CNLC分期、T分期、微血管侵犯(MVI)数量、血管侵犯、血清AFP表达水平与HCC患者总生存期密切相关(图2C-H,P<0.05)。具体结果见表2。
图2 HCC组织样本的预后生存分析[A.PON1高、低表达水平分组的总生存期的生存曲线(TCGA数据库);B-H.PON1 mRNA水平、BCLC分期、CNLC分期、T分期、MVI数量、血管侵犯与血清AFP水平的总生存期的Kaplan-Meier生存曲线(n=90)]
表2 90例HCC患者的临床病理参数资料
2.3 预后列线图的构建和验证
90例临床肝癌患者预后影响因素的单因素分析表明,PON1 mRNA水平、BCLC分期、CNLC分期、T分期、MVI数量、血管侵犯、血清AFP水平与HCC预后相关性较强(图3A,P<0.05)。多因素COX回归分析显示,BCLC分期(HR=5.309;95%CI:1.453～19.399)、血清AFP(HR=2.486;95%CI:1.166～5.299)和PON1(HR=3.157;95%CI,1.489～6.691)是影响HCC患者预后的独立危险因素(图3B,P<0.05)。联合BCLC分期、血清AFP水平、PON1 mRNA水平三项指标,建立的预测HCC患者1、2、3年总生存率列线图模型的C-index为0.757(95CI%:0.716～0.797)(图3C)。图3D所示,该模型在1、2、3年总生存率的校准曲线与理想曲线(斜率=1)拟合较好。
图3 临床样本的Cox回归分析与预后列线图的构建和验证(n=90)(A、B.单因素和多因素 Cox 回归分析;C.联合BCLC分期、血清AFP、PON1表达水平,用于1、2、3年总生存率预测的列线图;D.用于1、2、3年总生存率预测的列线图校准曲线)
2.4 HCC中PON1表达与免疫浸润的相关性分析
对TCGA数据库中HCC样本的PON1表达与免疫细胞浸润水平进行分析。结果显示,PON1的表达与Treg细胞、淋巴毒性细胞、DC细胞、中性粒细胞、Th17细胞浸润水平呈正相关,而与Th2细胞、T辅助细胞、CD56bright NK细胞、TFH细胞、效应记忆T细胞(Tem细胞)、活化的DC细胞、巨噬细胞浸润水平呈负相关(图4A,P<0.05)。对PON1高、低表达水平的分析结果显示,低PON1表达的Treg细胞、DC细胞、中性粒细胞、Th17细胞的细胞丰度显著下降,而Th2细胞、T辅助细胞、CD56bright NK细胞、TFH细胞、Tem细胞、活化的DC细胞的细胞丰度显著上调(图4B,P<0.05)。
图4 PON1与免疫浸润之间的相关性[A.免疫浸润与PON1表达之间的相关性。Treg细胞、淋巴毒性细胞、DC细胞、中性粒细胞、Th17细胞浸润水平与PON1呈正相关,Th2细胞、T辅助细胞、CD56bright NK细胞、TFH细胞、Tem细胞、活化的DC细胞、巨噬细胞浸润水平与PON1呈负相关(P<0.05);B.低PON1表达组Th2细胞、T辅助细胞、CD56bright NK细胞、TFH细胞、Tem细胞、活化的DC细胞浸润丰度显著上调,而Treg细胞、DC细胞、中性粒细胞、Th17细胞浸润丰度显著下调]
肝癌是一种由慢性炎症引起的癌症[5]。慢性炎症会导致氧化/亚硝化应激和脂质过氧化反应,产生过量的氧化应激,参与肝损伤的发生和发展,被认为是急慢性肝脏疾病的病理生理基础,与肝癌的发生密切相关[16]。PON1是一种由肝脏合成的水解芳香族羧酸酯、有机磷和碳酸盐的酯酶,存在于血液和肝脏中,与高密度脂蛋白(HDL)结合,其主要功能是保护HDL及低密度脂蛋白(LDL)免受氧化修饰,起着抗氧化损伤的作用。研究发现,PON1可抑制单核细胞和巨噬细胞的黏附,减轻慢性炎症[17]。
PON1在肝癌患者中异常低表达,可能是机体长期处于慢性炎症及氧化应激状态,利于癌细胞存活和增殖。本研究对PON1的mRNA在HCC中的表达及预后价值进行分析。结果表明,与癌旁组织相比,90例HCC患者中PON1 mRNA的表达水平降低,与HCC患者不良预后密切相关,与数据库结果及文献报道一致[8,18]。PON1的mRNA表达水平、BCLC分期及血清AFP是HCC患者预后的独立危险因素,联合三个指标建立的预后列线图模型具有良好的预测性能及临床实用价值。且PON1的表达与免疫浸润水平密切相关,提示PON1可能在HCC的肿瘤免疫微环境中发挥重要作用。
肿瘤有着复杂的生态系统,而肿瘤微环境对肿瘤的进展有调节作用[19]。肿瘤微环境中,不止免疫细胞有富集程度的差异,其他组成成分和功能差异对癌症发生发展也有着重大影响[20]。本研究结果表明,PON1的减少仍可能影响肿瘤细胞和免疫细胞的浸润。PON1表达与多种免疫细胞丰度呈相关性。此外,T细胞耗竭的标志基因与PON1表达显著相关。因此,PON1低表达可能参与调节HCC中免疫细胞浸润,并且与HCC患者的预后不良密切相关。有研究表明,PON1参与肿瘤相关的炎症调控,其抗炎活性依赖于与HDL的结合[21]。另外,PON1在体内外均能直接抑制巨噬细胞的炎症反应[22]。然而,PON1在HCC免疫微环境中的具体作用机制还需进一步研究证实。
综上所述,低表达的PON1可作为肝癌患者预后不良的潜在标志物,PON1联合血清AFP水平、BCLC分期构建的预测模型,可以帮助医生更好地为患者制定更科学、有效的治疗方案。
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