张 爱,朱 宁,杨路路,方 媛,王劲松,李 俐
结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是继肺癌和乳腺癌之后的全球第三大常见癌症类型。流行病学研究发现,结肠癌的发病率呈上升态势。即使在进行根治性切除的CRC患者中,仍有40%～50%的患者复发并死于转移性疾病[1]。肿瘤TNM分期是CRC患者治疗和预后评估的一项重要指标,但临床研究发现相同的TNM分期患者对治疗反应不同,预后也不同,表明TNM分期还无法精确地预测患者预后。近些年研究表明,肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用[2]。研究发现中性粒细胞除了具有直接杀菌活性外,还可以通过释放多种蛋白酶来调节血管生成和组织重塑[3-4]。越来越多的研究表明,肿瘤相关中性粒细胞(tumor-associated neutrophils, TANs)通过分泌一些因子引起致癌或加速癌细胞增殖、肿瘤血管生成、迁移和侵袭。文献报道TANs与胃癌、胆道癌和肾细胞癌等肿瘤的预后相关[5-7]。肿瘤促纤维间质反应(desmoplastic reaction, DR)是指机体对癌细胞引起的肿瘤周围间质的反应,并发现不成熟型DR与CRC、胃癌和胰腺癌患者预后不良相关[8-11]。目前CRC中TANs与DR的关系尚未见文献报道。本研究使用CD66b染色来标记CRC中TANs,分析CRC中TANs和DR的的临床病理学意义及两者的相关性。
1.1 临床资料收集2016～2017年南京医科大学附属南京医院(南京市第一医院)病理科诊断的CRC手术切除标本,剔除临床资料不全、行新辅助治疗或合并其他严重疾病者,共纳入240例。其中男性155例,女性85例;年龄<70岁115例、≥70岁125例,平均68.65岁;低+中分化腺癌171例,高分化腺癌69例;pTNM分期：Ⅰ+Ⅱ期132例,Ⅲ+Ⅳ期108例。病例均由2名高年资病理医师对HE切片进行重新评估,判断其分化程度、浸润深度、脉管侵犯、神经侵犯、淋巴结转移等指标。
1.2 方法手术切除标本均经10%中性福尔马林固定,常规石蜡包埋,4 μm厚切片,行HE和免疫组化染色。免疫组化染色采用EnVision法,在Dako Autostainer Link48免疫组化仪上进行,具体染色步骤参照仪器说明书进行。兔抗人CD66b单克隆抗体(克隆号EPR25354-2)购自Abcam公司,稀释度1∶20 000。
1.3 结果判断
1.3.1TANs判读 形态学上,中性粒细胞是多形核细胞,细胞核呈分叶状,染色质聚集、胞质嗜酸性。TANs定义为仅浸润在肿瘤上皮细胞或肿瘤间质内的中性粒细胞,排除肿瘤腔内中性粒细胞伴粉刺型坏死、紧邻坏死、隐窝破裂黏膜溃疡的区域。TAN判读方法参考相关文献[12-13],即计数10个高倍视野中TANs的数量,取平均值作为该病例的TANs。根据每100个肿瘤细胞中<5、5～15和>15个中性粒细胞分别归为中性粒细胞缺乏型(NP)、中性粒细胞中间型(NI)和中性粒细胞丰富型(NR)。
1.3.2DR判读 DR的分类标准参照相关文献分为成熟型、中间成熟型和不成熟型[14]。成熟型：是指纤细的胶原纤维呈多层分层状、规则性排列,不含任何黏液基质或瘢痕疙瘩样胶原纤维;中间型：是指当瘢痕疙瘩样胶原混杂在成熟间质中时,通常与成熟胶原纤维方向平行;不成熟型：是指肥胖型的纤维母细胞散乱排列伴有明显的黏液样基质。由2名高年资病理医师对所有肿瘤切片进行DR评估,判读结果不一致者则由病理医师在多头显微镜下进行会诊,得出判读结果。
1.4 统计学分析数据均使用SPSS 27.0软件进行统计学处理。采用描述性统计数据分析其临床病理特征。应用χ2检验或Fisher精确概率法分析肿瘤内CD66b+TANs和DR分类与CRC临床病理特征的相关。Kaplan-Meier法分析CD66b+TANs和DR与CRC患者预后的关系。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 CRC中CD66b+TANs、DR与临床病理特征的关系CRC中CD66b+TANs NR 29例,NI 47例,NP 164例(图1)。为了方便分析,将NI/NP合并一组,结果显示CRC中CD66b+TANs与患者年龄、性别、肿瘤大小、发病部位、神经侵犯和淋巴结转移均无关(P>0.05),而与组织学分级、脉管侵犯、pTNM分期显著相关(P<0.05,表1)。进一步分析发现,CRC中CD66b+TANs NR者,pTNM分期更高,分化更差,更容易出现脉管侵犯。DR中,不成熟型85例,中间型63例,成熟型92例(图2),CRC中DR与患者性别、年龄、发病部位、肿瘤大小、脉管侵犯等均无关(P>0.05),而与肿瘤分化程度、神经侵犯、淋巴结转移、pTNM分期密切相关(P<0.05,表1)。
表1 结直肠癌中CD66b+TANs、DR与临床病理特征的关系
图1 结直肠癌中TANs分类：A.TANs缺乏型;B.TANs中间型;C.TANs丰富型;D.CD66b在TANs缺乏型中的表达,EnVision法;E.CD66b在TANs中间型中的表达,EnVision法;F.CD66b在TANs丰富型中的表达,EnVision法
图2 结直肠癌中DR分类：A.DR成熟型;B.DR中间型;C.DR不成熟型
2.2 CRC中CD66b+TANs、DR与预后的关系与CD66b+TANs NI和NP CRC患者相比,CD66b+TANs NR CRC患者的3年总生存率(overall survival, OS)较低,差异有统计学意义(P=0.065,图3A)。CD66b+TANs NR的CRC患者3年OS明显低于NI/NP CRC患者(P=0.021,图3B)。不同类型DR CRC患者的3年OS差异有统计学意义,伴有不成熟型DR的CRC患者3年OS最低(图3C)。多因素Logistic回归分析显示：TANs和DR是CRC预后的独立影响因子(表2)。
表2 结直肠癌中单因素和多因素Logistic回归分析
图3 结直肠癌中CD66b+TAN和DR与患者3年总生存期的Keplan-Meier生存曲线：A.CD66b+TANs NR结直肠癌患者的3年总生存期低于NI和NP结直肠癌患者;B. CD66b+TANs NI/NP结直肠癌患者的3年总生存期高于CD66b+ TANs NR结直肠癌患者;C. DR不成熟型、中间型和成熟型结直肠癌患者的3年总生存期
2.3 CRC中CD66b+TANs与DR的相关性CRC中CD66b+TANs为NR者,肿瘤间质不成熟型17例(20.0%)、中间型6例(9.5%)和成熟型6例(6.5%);而CD66b+TANs为NI/NP者,间质不成熟型68例(80.0%)、中间型57例(90.5%)和成熟型86例(93.5%)。相关性分析显示,随着CD66b+TANs数量增加,DR由成熟型转变至未成熟,TANs与DR呈负相关(r=-0.176,P=0.006,表3)。
表3 结直肠腺癌中CD66b+TANs与DR的相关性[n(%)]
目前研究已表明恶性肿瘤的发生、发展不仅涉及恶性肿瘤细胞,而且还与TME密切相关。TME是一种由各种细胞类型包括癌症相关性纤维母细胞、内皮细胞、免疫细胞和细胞外成分组成的复杂系统。TME内各种成分通过多种机制影响肿瘤细胞的进展,进而影响患者的预后。TANs不仅是炎症微环境内一种主要的组成成分,也是肿瘤中一种主要的浸润性免疫细胞成员[15]。现有的研究发现TANs以复杂和多用途的方式起作用,对癌细胞表现出直接的细胞毒性抑制转移,但也能够发挥促癌作用,如新生血管形成、促进癌细胞迁移、上皮-间叶转化等[16-17]。
CRC中肿瘤内中性粒细胞的临床病理学意义研究结果尚不一致,Galediero等[18]采用免疫组化法研究了271例Ⅰ～Ⅳ期CRC标本中CD66b和髓过氧化物酶(MPO)在中性粒细胞中的表达,结果发现CD66b是识别CRC组织中TANs的一种可靠标志物,Ⅳ期CRC患者中CD66b+TANs数量明显低于Ⅰ～Ⅲ期,Cox分析显示较高的TANs密度与预后好相关。另外,该研究还发现较高的TANs密度与基于5-FU化疗有较好的反应。Ye等[19]使用ssGSEA和CIBERSOTR工具分析GEO和TCGA数据库中1 802例CRC中肿瘤浸润性免疫细胞包括CD66b+TANs的预后价值,并对1 008例CRC活检标本进行CD66b免疫组化检测,研究结果显示高度丰富的CD66b+TANs与CRC预后相关,而且是一个独立的预后因子。Yin等[20]研究发现在CRC浸润前沿CD8+肿瘤浸润性淋巴细胞和CD66b+TANs数量对预测CRC患者的生存可提供有意义的预后价值,研究结果发现肿瘤浸润前沿CD66b+TANs数量降低与CRC淋巴结转移密切相关,且与CRC患者低生存期和无瘤生存期均相关。这些研究结果提示,CD66b+TANs在CRC中的临床病理学意义还需进一步研究。本研究应用免疫组化法检测240例CRC肿瘤组织内CD66b+TANs数量,分析CD66b+TANs数量与CRC临床病理特征及预后的关系,结果显示CRC中CD66b+TANs数量与组织学分级、脉管侵犯、pTNM分期显著相关;进一步分析CD66b+TANs与CRC患者预后的关系发现,NR CRC患者与NI/NP CRC患者相比,3年OS更差,提示CRC组织内CD66b+TANs数量可能促进CRC的侵袭转移,肿瘤组织中CD66b+TANs数量高可能预测CRC患者不良的预后。
DR最早由Ueno等[21]提出,他们根据“瘢痕疙瘩样”胶原纤维和黏液样基质将纤维性癌性间质分为成熟型、中间型和不成熟型3类。最近对DR的组织学特征和不同类型的确定进行了更明确的定义[22-23]。在CRC研究中,Uneo等[24]的研究结果显示DR类型与肿瘤部位、pT和pN分期、肿瘤分化、静脉侵犯、肿瘤出芽和克隆氏样淋巴结反应明显相关,不成熟型DR与肝、肺、淋巴结、腹膜和局部区域高复发率有关,而且5年无瘤生存率在成熟型DR组高于未成熟型DR组。一项多中心研究也发现,DR分类是Ⅱ期CRC患者5年无复发生存的独立危险因素,且DR分类与肿瘤出芽和静脉侵犯存在显著相关性[25]。最近一项三期前瞻性验证研究结果显示991例Ⅱ期结肠癌患者中,5年无复发生存率在成熟型组最高,其次为中间型,不成熟型组最低;多因素分析显示DR分类是一个独立的预后因素,也是预测无复发生存的第一个分割因子,其次为T分期、微卫星不稳定状态和肿瘤出芽[26]。本研究结果显示,CRC中DR分类与肿瘤分化程度、神经侵犯、淋巴结转移、pTNM分期密切相关,具有不成熟型DR的CRC具有更加侵袭性临床生物学行为,进一步分析还发现不成熟型DR的CRC患者3年OS明显低于具有中间型和成熟型DR的CRC患者,且与Uneo等研究结果相似,多因素分析显示DR类型是CRC患者3年OS的独立预后因素,本研究结果进一步证实了CRC中DR类型不仅可影响肿瘤细胞的生物学行为,而且还可预测CRC患者的预后。
TME中含有多种成分,它们之间相互作用组成一个复杂的网络影响恶性肿瘤的发生、发展。TME中免疫细胞和间质细胞的相互关系目前还没有深入研究。Akimoto等[27]应用多种免疫荧光技术分析了908例CRC中T细胞和巨噬细胞与DR的关系,研究结果显示不成熟型DR与较低的上皮内CD3+CD8+CD45RO+细胞和间质M1样巨噬细胞相关,表明在CRC TME内肿瘤上皮内记忆细胞毒性T细胞和间质M1样巨噬细胞与间质细胞可能发生相互作用影响肿瘤细胞的生物学行为。Gonzalez等[28]研究也发现CRC中上皮内肿瘤浸润性淋巴细胞与低肿瘤出芽和非黏液样DR明显相关,提示TME中各种成分可能存在交互作用。本实验结果显示CRC中CD66b+TANs与DR分类呈负相关,CD66b+TANs越丰富的CRC,其DR越不成熟,提示CD66b+TANs可能通过分泌一些细胞因子影响DR的成熟,具体机制有待于进一步研究。
总之,CD66b+TANs和DR在CRC的侵袭转移中发挥重要作用,CD66b+TANs丰富型和不成熟型DR的CRC患者具有不良的预后,CD66b+TANs与DR之间的负相关关系提示TANs可能影响DR类型。在临床实践中常规报告CD66b+TANs和DR类型可有助于预测CRC患者的预后。
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