许 薇, 王 亮, 莫安薇, 黄琰菁
肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)指肿瘤细胞生存的局部环境,是一种复杂的动态环境,与肿瘤细胞增殖、转移和免疫逃逸等紧密相关。TME是实体瘤发生、发展的条件,也是机体抵御肿瘤的关键地方。TME中的肿瘤浸润性自然杀伤(natural killer,NK)细胞比其他淋巴免疫细胞具有更强大的细胞毒性作用和免疫调节能力,能够在没有抗原呈递的情况下快速发挥抗肿瘤活性,在抗肿瘤免疫中起着重要作用。除此之外,NK细胞分泌的细胞因子及颗粒蛋白能够杀伤靶细胞,尤其是肿瘤细胞。深入了解TME将会为癌症治疗找到新的途径和方法,基于功能更加强大的肿瘤浸润性NK细胞的研究有可能发掘出更高效的抗肿瘤治疗方案[1]。本文就肿瘤浸润性NK细胞在免疫治疗中的研究进展作一综述。
NK细胞是一种大粒状免疫淋巴细胞,可分为CD56dim和CD56bright2个亚群。它是人体免疫的第一道防线,约占血液中免疫细胞的15%[2]。当肿瘤发生时,部分外周NK细胞浸润至TME,被称为肿瘤浸润性NK细胞。肿瘤浸润性NK细胞在TME中约占总淋巴细胞的5%[3]。不同免疫器官中的NK细胞来源不同,其表型也不同,这使得转移至不同肿瘤的肿瘤浸润性NK细胞的表型也不同。在骨髓中,NK细胞主要来源于CD34+造血干细胞[4],主要为成熟的CD56dimNK细胞[5]。CD34dimCD45RA+β7bright造血前体细胞从骨髓中转移至淋巴结,在白介素-15、白介素-2和活化T细胞的作用下分化为特异的CD56brightNK细胞[6-7]。NK细胞成熟过程主要可分为4期：在Ⅰ期中,CD34dimCD45RA+β7bright造血前体细胞分化为CD10+β7+CD34+CD117-CD94-HLA-DR+CD56+NK细胞;在Ⅱ期中,进一步分化成CD10+β7+CD34+CD117+CD94-HLA-DR+CD56+NK细胞;在Ⅲ期中,再进一步分化成CD10-β7-CD34-CD117+CD94-HLA-DR-CD56+NK细胞;在Ⅳ期中,继续分化成CD10-β7-CD34-CD117+CD94+HLA-DR-CD56+NK细胞[8]。但其在淋巴结的分化过程中的具体细节仍未被研究透彻。不同亚群的NK细胞的分化成熟程度差异较大。CD56dimNK细胞主要在骨髓中产生,而CD56brightNK细胞主要在淋巴结中发育成熟。在免疫器官中发育成熟的NK细胞会被趋化因子吸引至TME中变成肿瘤浸润性NK细胞[9]。不同实体瘤的肿瘤浸润性NK细胞的表型不同：在黑色素瘤中为CD56dimCD57dimCD69+CCR7+KIR+肿瘤浸润性NK细胞;在肾癌中为CD16brightCD56dim肿瘤浸润性NK细胞;在前列腺癌中为未成熟的CD56bright肿瘤浸润性NK细胞[10-13]。出现这种现象的原因,可能与肿瘤细胞的代谢能力、免疫逃逸能力等不同特性有关。深入了解不同表型肿瘤浸润性NK细胞的功能,改变免疫微环境里的免疫细胞组成可能是提高免疫疗效的重要方法。
肿瘤浸润性NK细胞可通过分泌含有穿孔素和颗粒酶B的细胞毒性颗粒、分泌促炎细胞因子和表达死亡配体等方式发挥抗肿瘤效应[14]。不同亚群的NK细胞的功能也不相同。CD56brightNK细胞能产生丰富的促炎细胞因子;而CD56dimNK细胞能分泌大量的细胞毒性颗粒,具有较强的溶解细胞能力[15]。
2.1分泌细胞毒性颗粒 穿孔素和颗粒酶是NK细胞分泌的细胞毒性颗粒的重要组成部分,是一种小分子细胞毒性蛋白质,在NK细胞发挥抗肿瘤效应中起着重要作用。在TME中受外来抗原刺激的NK细胞会产生大量的穿孔素和颗粒酶家族分子[16]。人体内存在5种颗粒酶：颗粒酶A、颗粒酶B、颗粒酶H、颗粒酶K和颗粒酶M。肿瘤浸润性NK细胞分泌穿孔素在靶向肿瘤细胞膜上产生孔,使得颗粒酶B能够进入细胞内。颗粒酶B进入靶细胞后可通过多种途径促进肿瘤细胞凋亡：(1)直接切割半胱天冬酶,破坏靶细胞DNA和细胞骨架,导致靶细胞发生凋亡。(2)触发靶细胞线粒体凋亡途径,导致线粒体外膜透化[17]。总之,通过增加CD56dimNK细胞的数量可能使具有较强抗肿瘤作用的细胞毒性颗粒增多来提高抗肿瘤的效果。
2.2分泌促炎细胞因子 肿瘤浸润性NK细胞分泌的促炎细胞因子主要为γ-干扰素(interferon-gamma,IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α),IFN-γ和TNF-α都属于多效性细胞因子,均具有促癌和抗癌作用。在TME中的IFN-γ主要由肿瘤浸润性NK细胞产生。研究表明,IFN-γ通过增加主要组织相容性复合物Ⅰ类蛋白和Ⅱ类蛋白的表达,上调肿瘤细胞表面程序性死亡配体1、IFN-γ-FN1抑制通路等方式增加肿瘤细胞被免疫细胞识别的风险,从而增加抗肿瘤效果[18]。也有研究认为,IFN-γ可通过诱导趋化因子[C-X-C基序趋化因子配体9(C-X-C motif chemokine ligand 9,CXCL9)、CXCL10]的产生,将外周NK细胞吸引至TME中,间接发挥抗肿瘤作用[19]。在促癌方面,持续的干扰素受体信号转导会使免疫细胞产生耐受性,降低免疫应答的能力,从而发挥促癌作用[20]。另外,IFN-γ可以通过增加TME中的血管生成、上调免疫抑制因子、抑制免疫效应细胞来发挥作用[21]。TME中的TNF大部分由巨噬细胞分泌,其余部分由淋巴细胞和肿瘤细胞产生。TNF-α的生物学活性占TNF家族总活性的70%～95%,是主要效应因子。TNF-α被认为是一种有效的促炎细胞因子,主要通过2种TNF受体(Ⅰ型、Ⅱ型)发挥抗癌和促癌的双重作用[22]。有研究证实,Ⅰ型TNF受体存在于所有细胞表面,Ⅱ型TNF受体仅存在于免疫细胞表面[23]。Ⅰ型TNF受体主要参与抗肿瘤作用。当TNF-α与Ⅰ型TNF受体结合后会激活caspase-8和混合谱系激酶结构域样蛋白,从而诱导肿瘤细胞凋亡及血管内皮细胞坏死[24]。相反,Ⅱ型TNF受体主要促进肿瘤的发生和转移。TNF-α与Ⅱ型TNF受体通过促进肿瘤血管的形成、诱导调节性T细胞的增殖和活化、激活核因子κB损伤的DNA等方式发挥促癌作用[25]。由此可见,CD56brightNK细胞能产生丰富的促炎细胞因子IFN-γ和TNF-α从而发挥抗癌和促癌双重作用,通过调控CD56brightNK细胞的数量来提高抗癌疗效具有较大的不确定性。
2.3表达死亡配体 肿瘤浸润性NK细胞通过表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体[tumor necrosis factor(TNF)-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL]和Fas配体(Fas ligand,FasL)诱导肿瘤细胞凋亡。TRAIL和FasL在多种免疫细胞表面表达,死亡受体和Fas在肿瘤细胞表面数量高于正常组织细胞[26]。这种差异性分布使得TRAIL和FasL能特异性地针对肿瘤细胞,避免损伤正常细胞。TRAIL是一种Ⅱ型跨膜蛋白,可与多种死亡受体结合,主要通过结合含有死亡结构域(death domain,DD)的死亡受体TRAIL-R1和TRAIL-R2诱导细胞凋亡。在Ⅰ型细胞中,TRAIL与TRAIL-R1和TRAIL-R2结合,导致死亡受体的DD结构发生改变,DD与细胞内适配器分子Fas相关DD、半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-10结合形成死亡诱导信号复合物后激活底物半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-10,将其释放至细胞质内,进一步激活半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-6和半胱天冬酶-7,最终导致细胞凋亡[27-28]。在Ⅱ型细胞内,X连锁凋亡抑制剂抑制了半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-6和半胱天冬酶-7的激活[26]。活化的半胱天冬酶-8将Bid(BH3相互作用结构域死亡激动剂)切割成小段,小段Bid导致线粒体外膜透化并产生细胞色素c,细胞色素c与凋亡蛋白酶激活因子形成细胞凋亡复合物,细胞凋亡复合物在细胞质中激活半胱天冬酶原-9等,最终获得足够的半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-6和半胱天冬酶-7启动细胞凋亡程序[29-30]。FasL也是一种Ⅱ型跨膜蛋白,与肿瘤细胞表面的Fas结合,在肿瘤免疫监视中起重要作用。肿瘤浸润性NK细胞表面的FasL与靶细胞表面的Fas结合后,通过外在凋亡途径导致细胞凋亡[31]。
2.4介导抗体依赖性细胞毒性(antibody dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)途径 ADCC的3个重要组成部分为抗体、靶细胞和NK细胞。ADCC是NK细胞介导的杀伤肿瘤细胞的另一种关键机制,对于调控肿瘤进展具有重要作用。NK细胞是发挥ADCC作用的主要免疫细胞类型。抗体的Fab段与肿瘤细胞结合后,其Fc段与NK细胞表面的FcR结合,然后启动NK细胞内信号转导,促使NK细胞释放细胞内容物,通过TRAIL和Fas途径诱导肿瘤细胞凋亡,实现特异性靶向杀伤[32]。NK细胞介导的ADCC是治疗恶性肿瘤的重要机制,对于调控肿瘤进展具有重要作用。NK细胞介导的ADCC为治疗恶性肿瘤提供了新的机会。
肿瘤免疫疗法通过调控免疫系统杀伤肿瘤细胞,多种恶性肿瘤的治疗中显示出潜力。为了增强NK细胞对实体瘤的杀伤性,通过引入人工合成的嵌合抗原受体(chimeric antigen-receptor,CAR),一定程度上增强了NK细胞的抗肿瘤能力,过继性免疫细胞疗法中的CAR-NK细胞疗法由此诞生。该疗法在多项恶性肿瘤的临床试验中受到关注：表达因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)-CAR NK-92细胞可用于治疗转移性乳腺癌;ErbB2/HER2-CAR NK细胞的抗肿瘤活性显著增强,可用于治疗各种ErbB2阳性的恶性肿瘤;携带靶向EGFRvⅢ的CAR-NK细胞可通过细胞凋亡抑制胶质母细胞瘤的生长;编码上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)的CAR-NK细胞可对特定的乳腺癌表现出高选择性的细胞杀伤活性等[33]。CAR-NK细胞疗法由表达表面受体的基因工程NK细胞组成,该受体特异性地靶向表达在肿瘤细胞表面的抗原。不同来源的NK细胞有不同的表型,最终的疗效也不一样：脐带血的NK细胞表达低CD16、CD56、NKG2A和低KIR,增殖能力强并对细胞因子刺激非常敏感;外周血的NK细胞主要表达CD56dim,增殖能力较弱且制备过程复杂;诱导多能干细胞的NK细胞表达低CD16、高NKG2A和低KIR,增殖能力强但细胞毒性弱[34]。CAR的嵌入使得NK细胞在杀死肿瘤细胞方面具有选择性和高效性。CAR-NK细胞具有CAR依赖和CAR独立靶向能力,能够降低肿瘤逃避风险[35]。基于NK细胞的CAR-NK细胞免疫疗法是一种非常有前景的癌症治疗方法,可以显著提高肿瘤浸润性NK细胞的抗肿瘤能力,并且不同表面受体的嵌入使该免疫疗法在杀死肿瘤细胞方面具有选择性和高效性。未来还需大量的研究来证明其疗效和安全性。
NK细胞在肿瘤治疗中起着重要作用,基于NK细胞的免疫疗法能够治疗难治性恶性肿瘤。经过基因工程改造产出不同的CAR-NK细胞能够对不同的实体瘤产生效应,这些效应大部分具有特异性,尽管目前尚未广泛应用于临床,但其在实体瘤的治疗中较有潜质。肿瘤浸润性NK细胞的表型与功能密切相关,通过添加或减少某个特定表型的表达可以使得其具有不同的功能,编码不同嵌合受体的NK细胞能够针对不同的肿瘤,CD56的表达也可影响其主要分泌物的种类。因此,明确肿瘤浸润性NK细胞的表型与功能有助于开发新型高效的基于NK细胞的免疫疗法,未来仍需要大量的研究验证。NK细胞是肿瘤免疫治疗的新靶点,但仍需要进一步了解如何更好地进行调控。
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