刘 潇，王曌慧，魏心怡，周 玥，赵 丽，王 玥，3，李俊发*
1.首都医科大学 基础医学院 神经生物学系，北京 100006；
2.首都医科大学附属北京安定医院 国家精神心理疾病临床医学研究中心 精神疾病诊断与治疗北京市重点实验室，北京 100088；
3.首都医科大学 人脑保护高精尖创新中心，北京 100069
阿尔茨海默病(Alzheimer"s disease,AD)的主要临床表现为认知功能障碍。糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一种以高血糖为特征的代谢性疾病。AD和DM之间密切相关,研究发现,DM患者患有AD的风险增加[1],但具体分子联系尚不清楚。
AD的全基因组关联研究得出的髓系细胞触发受体-2(triggering receptor expressed on myeloid cells-2,TREM2)与神经变性病发生发展密切相关[2]。与此同时,有一些实验发现TREM2和DM神经功能失调相关,本实验室前期工作发现,第8和第15周DM小鼠前额叶皮层TREM2蛋白mRNA水平明显增加[3]。以上研究提示TREM2可能是AD和DM的共同致病相关基因。
本研究在PubMed找到一个数据集GSE143951,展示了TREM2R47H突变AD患者iPSCs分化为神经元的基因表达情况。目前只在PubMed数据集检索到GSE161355数据库记录了DM患者脑组织转录组的变化。本研究将两个数据集联合起来,探讨了DM和AD认知功能障碍中TREM2突变相关的核心基因及可能的治疗靶点,为DM合并AD患者治疗提供新的实验依据。
1.1 材料
1.1.1 动物:6～8周龄的SPF级雄性成年野生型(wild-type,WT)C57BL/6J小鼠和Trem2小胶质细胞特异性敲除(Trem2CKO)C57BL/6J小鼠,体质量18～22 g(北京维通利华实验动物有限公司)。已经通过首都医科大学伦理委员会审查(AEEI-2021-023)。
1.1.2 试剂:链脲佐菌素(streptozocin,STZ购自Sigma Aldrich公司);血糖试纸(江苏鱼跃医疗设备股份有限公司);SNAP25多克隆抗体(Proteintech公司);羊抗兔IgG抗体 (Thermo Fisher Scientific公司);羊抗鼠IgG抗体 (Jackson ImmunoResearch公司)。
1.2 方法
1.2.1 微阵列数据的收集:微阵列表达谱数据集GSE161355,GSE143951和 GSE36980从GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下载。其中微阵列数据集GSE161355基于平台GPL570 ([HG-U133_Plus_2] Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array);微阵列数据集GSE143951基于平台GPL16043[ GeneChip®PrimeViewTMHuman Gene Expression Array(with External spikes-in RNAs)];微阵列数据集GSE36980基于平台GPL6244 ([HuGene-1_0-st] Affymetrix Human Gene 1.0 ST Array[transcript (gene) version])。GSE161355包含:糖尿病患者和健康人大脑皮层神经元,皮质星形胶质细胞和神经血管的内皮细胞的基因表达变化; GSE143951分组为:AD患者和健康人iPSCs的基因表达变化;GSE36980分组为:AD患者和健康人额叶皮层,海马和颞叶皮层的基因表达变化。
1.2.2 差异表达的分析:采用在线分析工具GEO2R进行差异表达分析;在GSE131655中,比较DM患者和健康对照的表达谱来鉴定DEGs。在GSE143951中,通过比较TREM2中携带R47H突变的患者和正常对照个体的iPSCs的表达谱来鉴定DEGs。P值和调整后的P值采用t检验计算。保留每个样本中符合以下标准的基因: 1)|log2(fold-change)|>1;2)调整后的P<0.05。根据细胞类型将GSE131655数据集分为3组。星形胶质细胞、内皮细胞和神经元分别独立分析,3组的DEGs取交联合集。使用在线工具Venny 2.1(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)绘制了DEGs的维恩图。
1.2.3 蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络分析:PPI网络分析基于两种疾病中DEGs共同改变的Venn图结果,使用在线数据库STRING (https://string-db.org/)。将交互得分>0.4作为阈值。此外,利用Cytoscape v3.6.0软件对PPI网络进行可视化和构建。与相邻节点交互次数最多的节点称为中心节点。使用Cytohubba鉴定该网络中的核心基因。利用MCC(maximum Clique Centrality)算法,根据得到每个基因的度并排序,根据排序,将前4位确定为核心基因。MCODE(minimum Common Oncology Data Elements)算法用于识别显著基因簇并获得聚类得分(筛选标准:度截止值=2;节点评分截止值=0.2;k-core=2;最大深度=100)。最后,将所有结果相结合得到最终的核心基因。
1.2.4 Morris水迷宫:Morris水迷宫是检测动物空间学习记忆能力的一种行为学方法。具体步骤参考文献[4]的实验方法。
1.2.5 Western blot检测蛋白质表达:取小鼠大脑海马组织,加入RIPA、蛋白酶抑制剂,磷酸酶抑制剂,研磨组织,超声30个循环,每个循环持续30 s,间隔30 s,12 000×g,4 ℃,离心12 min,取上清,用BCA法测定蛋白质浓度,4 ℃一抗孵育过夜(稀释比例均为1∶500),TBST清洗3次,室温孵育二抗2 h,TBST清洗3次,显影,Image J测定蛋白质吸光度值,以β-肌动蛋白(β-actin)为内参,计算蛋白质条带吸光度值的比值。
1.3 统计学分析
2.1 差异表达基因的筛选
在本研究中,选择了2种不同疾病的微阵列数据集,通过生物信息学方法探索2种疾病中起作用的DEGs及其显著性。在GSE161355中,星形胶质细胞中有2 282个DEGs,1 145个上调和1 137个下调基因;内皮细胞中有2 682个DEGs,包括1 545个上调和1 137个下调基因;神经元中有993个DEGs,包括653个上调和340个下调基因。GSE143951共有19 152个DEGs,其中上调基因10 176个,下调基因8 976个。接下来,使用热图和火山图来可视化2个微阵列数据集中的DEGs,如图1A～H所示。此外,在2个数据集中,有53个DEGs在DM和AD之间重叠,其中14个基因上调共存,5个基因下调共存(图1I)。
A-C.respective volcano plots of three different cell types in GSE161355; The red plots represented upregulated genes (logFC>1 and P<0.05); The black plots represented nonsignificant genes (|logFC|<1 or P>0.05)); The blue plots represented downregulated genes (logFC<-1 and P<0.05);D-F.respective heatmaps of three different cell types of DEGs in GSE161355; Red rectangles represented high expression; Blue rectangles represented low expression;G.volcano plot of GSE143951;The red plots represented upregulated genes (logFC>1 and P<0.05); The black plots represented nonsignificant genes (|logFC|<1 or P<0.05); The blue plots represented downregulated genes (logFC<-1 and P<0.05);H.heatmap of DEGs in GSE143951; Red rectangles represented high expression; Blue rectangles represented low expression;I.venn diagram of DEGs from two microarray datasets.
2.2 DEGs的PPI网络分析
本实验使用STRING对GSE161355和GSE143951中发现的19个共同改变的DEGs进行了PPI分析,并通过Cytoscape进行了可视化(图2A)。通过MCC算法计算9个DEGs(图2B)。使用MCODE插件识别基因簇模块。在这个PPI网络中,确定了一个得分为3.33的模块(图2C)。根据基因的秩分布和MCODE插件的计算结果,本实验选择了DNER、GFAP、GRM5、SNAP25作为核心基因,是PPI网络中最重要的基因,可能在DM和AD中发挥重要作用。
A.based on the STRING online database, 8 DEGs were filtered into the DEGs PPI network; cytoscape network visualization of the 8 nodes and 8 edges; the nodes represented DEGs; the edges represented links between DEGs,Red represented upregulated genes; blue represented downregulated genes;B.based on cytohubba analysis Module 1 contained 8 nodes and 8 edges; different colors represented different rank of genes; C.based on Mcode analysis Module 2 which represented the most significant module from the PPI network contained 4 nodes and 5 edges.
2.3 4个核心基因在AD中的ROC曲线
通过网站(https://www.bioinformatics.com.cn)分析4个核心基因在GSE36980中,额叶皮质、海马和颞叶皮质的表达谱,并绘制ROC曲线。曲线下面积(AUC)可以用来评价ROC曲线的凹凸程度。结果显示,SNAP25在额叶皮层(AUC:0.764)(图3D)和海马(AUC:0.889)(图3H)的诊断价值最高,而GFAP在颞叶皮层的诊断价值最高(AUC:0.840)。其他基因的诊断价值如下::在额叶皮层,DNER(AUC:0.692),GFAP(AUC:0.662),GRM5(AUC:0.582)(图3A～C);在海马区,DNER(AUC:0.521)、GFAP(AUC:0.643)、GRM5(AUC:0.809)(图3E～G);在颞叶皮层,DNER(AUC:0.676),GRM5(AUC:0.818),SNAP25(AUC:0.800)(图3I～L)。由于SNAP25在额叶皮质和海马中均具有良好的诊断性能,假设SNAP25可能是额叶皮质和海马中DM和AD的生物标志物。
A-D.ROC curve of 4 hub genes in frontal cortex;E-H.ROC curve of 4 hub genes in hippocampus;I-L.ROC curve of 4 hub genes in temporal cortex;AUC area under the ROC curve; X-axis showed the 1-specifity and Y-axis showed the Sensity of each gene;M.Western blot showed the expression of SNAP25 in hippocampus of mice in each group;N.relative quantitative analysis of the total amount of SNAP25 in hippocampus of mice in each group;n=6-7; control.wild normal mice; DM.wild diabetes mice; DM+TREM2-/-.TREM2 CKO diabetes mice; *P<0.001 compared with each group.
2.4 Trem2敲除加重T1DM小鼠空间学习记忆障碍
与正常对照组相比,DM小鼠血糖和体质量水平在STZ注射后第2周开始分别升高和降低。说明DM小鼠模型构建成功(图4A,B)。STZ注射后8周通过Morris水迷宫测试发现与正常对照组小鼠相比,DM小鼠在水中找到平台的潜伏期明显延长(图4C),在平台所在象限游动所占时间百分比明显减少(图4D),游泳路径较为混乱(图4E)。Trem2敲除DM小鼠在学习记忆阶段潜伏期更长(图4C),平台所在象限所占时间百分比更少(图4D),游泳路径更加混乱(图4E)。同时,为了排除小鼠游动速度和小鼠个体视力差异对实验结果的影响,统计各组小鼠每天的游泳速度发现差异均无统计学意义(图4G),另外在实验的第9天,通过可视平台测试各组小鼠的视力情况,发现各组间差异均无统计学意义(图4F),说明DM小鼠出现的空间学习记忆功能障碍不会受到逃逸动机及感觉运动能力的影响。
A.changes of blood glucose in each group of mice at different periods; B.weight changes in each group; C.Morris water maze escape latency of mice in each group; D.the percentage of swimming time in each quadrant after the platform was removed on day 7 of the Morris water maze test; E.swimming tracks of mice in each group on day 7 of Morris water maze test; F.the escape latency of mice in each group was tested by visual platform on day 9 of the Morris water maze experiment; G.the average daily swimming speed of each group of mice in the Morris water maze experiment;CON+TREM2+/+.wild normal mice; CON+TREM2-/-.TREM2 CKO mice; DM+TREM2+/+.diabetes mice; DM+TREM2-/-.TREM2 CKO diabetes mice; n=6; *P<0.05, **P<0.001 compared with the normal control group.
2.5 DM小鼠海马SNAP25表达增加,TREM2影响DM小鼠海马SNAP25的表达
得到SNAP25为核心基因后,本研究利用DM WT和DMTrem2敲除小鼠,应用Western blot,检测了DM小鼠第8周时海马区SNAP25表达的变化。结果表明,DM小鼠海马区SNAP25表达明显增加,特异性敲除小胶质细胞Trem2的DM小鼠海马区SNAP25表达显著降低(图3M,N)。
TREM2在DM和认知功能障碍中两个疾病之间的联系和潜在的作用靶点尚不清楚。在本研究中所纳入的两个数据库分别涵盖了DM患者脑组织和TREM2R47H突变AD患者神经元基因的表达变化。
在本研究获取的4个核心基因中,结合本实验后续的ROC曲线验证和疾病相关生物过程关联的结果,SNAP25相较于其它3个基因更具有较大的研究潜力,它是一种在神经元中特异高表达的突触前膜蛋白。SNAP25在迟发性AD患者的脑脊液中明显升高。也有实验发现SNAP25多态性在DM中发挥一定作用[5]。但有趣的是,有实验发现AD患者大脑皮层、海马等特定区域突触丧失,SNAP25的表达显著降低[6]。本实验显示在DM小鼠大脑海马区域SNAP25蛋白表达水平与生物信息学分析结果相一致。Trem2敲除后表达降低提示TREM2可能上调SNAP25的表达,其具体的作用机制还需后续实验进一步探索。总之,结合以上研究,本研究结果提示TREM2有可能通过上述核心基因参与DM认知功能障碍。
综上所述,本研究成功筛选出与DM合并TREM2突变相关认知功能障碍的4个核心基因,这为治疗DM认知功能障碍提供了新的靶点。这项研究同时也存在了一些不足,目前尚未检索到TREM2突变DM患者的数据库,因此随着数据库的扩大,后续还需要进一步的实验探索。
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