夏书官，王声，任阳光，田艳艳，左永刚
（河南大学淮河医院甲状腺乳腺外科，河南 开封 475000）
全球癌症统计报告［1］数据显示，2020年女性乳腺癌新发病例达230万，约占新发癌症病例的11.7%，已超越肺癌居全球第一位；
乳腺癌也是导致女性癌症死亡的主要原因。虽然近年来手术、放化疗、免疫治疗、靶向治疗及内分泌治疗等手段在乳腺癌治疗中取得重要进展，但仍有部分患者在治疗后出现复发、转移甚至死亡，对女性健康造成严重危害。因此，探究乳腺癌发生发展的分子机制、寻找新的分子靶点对乳腺癌的诊断治疗及预后改善有重要意义。环状RNA（circular RNA，circRNA）是一类通过外显子或内含子序列可变剪接形成的单链闭合环状RNA分子，可充当微RNA（microRNA，miR）的分子海绵竞争性结合miR，进而改变靶mRNA表达状态［2］。最新研究［3］表明，circRNA在乳腺癌的发生发展过程中发挥重要调控作用，并可调节乳腺癌细胞增殖、凋亡和转移等生物学过程。YIN等［4］通过体外细胞实验发现，过表达circRNA转录因子25（transcription factor 25，TCF25）可作为miR-206的海绵促进胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力。陈旭轮等［5］研究显示，circRNA TCF25可通过靶向miR-128提高膀胱癌细胞生长增殖、迁移和侵袭能力。已有研究［6］显示，过表达miR-128可通过调节磷酸酯酶与张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）来增强乳腺癌细胞对阿霉素的敏感性。然而关于circRNA TCF25对乳腺癌细胞增殖、凋亡影响的研究尚未见报道。本研究通过体外实验探究circRNA TCF25靶向miR-128b对人乳腺癌细胞MCF-7增殖和凋亡的影响。
1.1 材料
1.1.1 细胞：人乳腺癌细胞MCF-7（美国ATCC细胞库，货号YBCC100943）。
1.1.2 药物与试剂：si-NC、si-circRNA TCF25、pcDNAcircRNA TCF25、miR-NC、miR-128b模拟物、miR-128b抑制剂、双荧光素酶报告载体均由宝生物工程（大连）有限公司设计合成。Lipofectamine 2000转染试剂盒（美国Invitrogen公司，货号11668019），RNase R酶（上海抚生实业有限公司，货号A-PJ1136），细胞核/细胞质细胞组分提取试剂盒（美国Biovision公司，货号 K266-25），噻唑蓝（MTT）细胞增殖检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号M1020），凋亡检测试剂盒（美国Biogems公司，货号62700-50），TRIzol总核糖核酸（RNA）提取试剂盒（上海联迈生物工程有限公司，货号LM80901B），反转录试剂盒（日本TaKaRa公司，货号RR036A），荧光定量PCR试剂盒（日本TaKa-Ra公司，货号RR420A），二喹啉甲酸（BCA）蛋白浓度测定试剂盒（美国AAT Bioquest公司，货号200619），双荧光素酶报告基因检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号D0010），兔抗人PTEN、细胞增殖核抗原-67（Ki-67）、caspase-3、活化的caspase-3、U6、β-actin单克隆抗体（美国Abcam公司，货号ab13847、ab34710、ab69949、ab26548、ab16105、ab22140），羊抗兔PTEN、Ki-67、caspase-3、活化的caspase-3、U6、β-actin多克隆抗体（美国Abcam公司，货号ab34106、ab22693、ab51102、ab20247、ab16419、ab10188）。
1.1.3 实验器材：S1000™384 Well型PCR仪（美国BIO-RAD公司），SuPerMax 3000AL型型多功能酶标仪（上海闪谱生物科技公司），Attune CytPix型流式细胞仪（美国Invitrogen公司），BPN-CRH型细胞培养箱（上海一恒科学仪器有限公司），DT-MINIE-135型电泳仪［德诺杰亿（北京）生物科技有限公司］，JP-2880型凝胶成像系统（上海金鹏分析仪器有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养、转染和分组：将人乳腺癌细胞MCF-7于37℃、5%CO2的细胞培养箱中常规培养，每2 d换液1次。待细胞生长至对数生长期，消化并离心收集细胞，按照1.0×104/孔接种至96孔板。根据Lipofectamine 2000转染试剂盒说明书分别将si-NC、si-circRNA TCF25、pcDNA-circRNA TCF25、miR-NC、miR-128b 模拟物、miR-128b 抑制剂、pcDNA-circ-RNA TCF25和miR-128b 模拟物转染至上述细胞，分别记作si-NC组、si-circRNA TCF25组、pcDNA-circ-RNA TCF25组、miR-NC组、miR-128b mimic组、miR-128b inhibitor组和pcDNA-circRNA TCF25+miR-128b mimic组，另取未转染人乳腺癌细胞MCF-7设为空白组，每组6个复孔。
1.2.2 细胞中circRNA TCF25、miR-128b表达：转染48 h后，通过TRIzol总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，合成互补脱氧核糖核酸（cDNA），根据PCR试剂盒说明操作步骤检测circRNA TCF25、miR-128b相对表达量。反应体系：正向、反向引物各1 μL，Real-Time Master Mix 10 μL，cDNA 2 μL，无酶双蒸水（RNase ddH2O）补足体系至20 μL。反应条件：95℃预变性2 min，95℃变性15 s，60℃退火1 min，72℃延伸30 s（循环40次）。circRNA TCF25，正向5’-TGAACCGATACGACAGTCC-3’，反向5’-ACGGG CATATATTACGTC-3’，产物长度146 bp；
miR-128b，正向5’-AGCCACATATCAGCACTT-3’，反向5’-CTT AGCATTGAGTATATCTG-3’，产物长度206 bp；
U6，正向5’-ACCGATCAGATACGAG-3’，反向5’-TGCAA ACGAGTTGACGTAGT-3’，产物长度177 bp；
β-actin，正向5’-GCACTAGCAGAGATCC-3’，反向5’-CATTG CACTGTCAGTA-3’，产物长度306 bp。引物均由宝生物工程（大连）有限公司设计合成。circRNA TCF25以β-actin为内参，miR-128b以U6为内参，通过2-△△Ct公式计算相对表达量。
1.2.3 RNase R酶消化实验进行circRNA鉴定：提取细胞总RNA后，将pcDNA-circRNA TCF25组分为RNase R组（加RNase R）和对照组（不加RNase R），逆转录后进行荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）反应，分别检测circRNA TCF25及其线性亲本基因TCF25在人乳腺癌细胞MCF-7中的表达水平，明确circRNA TCF25在人乳腺癌MCF-7细胞中的结构稳定性。其中，MCF-7正向5’-TGGCAGATCA CACGTAC-3’，反向5’-AATGCCCGATATTGAGAGT CGTA-3’，产物长度187 bp。circRNA TCF25和β-actin引物及反应条件同1.2.2。
1.2.4 核浆分离法检测circRNA TCF25的亚细胞定位：根据细胞核/细胞质细胞组分提取试剂盒的说明书进行操作，对pcDNA-circRNA TCF25组人乳腺癌MCF-7细胞进行核质分离。分别提取细胞质及细胞核RNA，将其逆转录成cDNA，以β-actin为内参，采用RT-qPCR检测circRNA TCF25分别在细胞质及细胞核中相对表达量，circRNA TCF25和β-actin引物及反应条件同1.2.2。
1.2.5 细胞增殖活力检测：将各组细胞按照1.0×104/孔接种至96 孔板上，分别在0、24、48、72 h时每孔加入20 μL MTT溶液（5 g/L）继续孵育4 h，吸弃孔内上清液，每孔加入150 μL 二甲基亚砜（DMSO）充分震荡溶解结晶物，通过多功能酶标仪检测490 nm处各孔的光密度（optical density，OD）值，以OD490nm值代表细胞增殖活力。
1.2.6 细胞凋亡检测：收集各组细胞，加入0.01%的胰酶消化制成1.0×104/mL的单细胞悬液。加入磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞，离心收集细胞，加入500 μL结合缓冲液制成单细胞悬液，分别加入5 μL的Annexin V-FITC和PI溶液室温下孵育10 min。于1 h内应用流式细胞仪检测，通过CELL Quest软件分析细胞凋亡率。
1.2.7PTEN、Ki-67、caspase-3mRNA表达检测：收集各组MCF-7细胞，采用RT-qPCR检测PTEN、Ki-67、caspase-3mRNA表达，方法同1.2.2。其中，PTEN正向5’-AGACGGAGAGGATGAATGTGC-3’，反向5’-AAC CGCGATTCCTCAATGCT-3’，产物长度344 bp；
Ki-67正向5’-ACCGTAGGTACAGTT-3’，反向5’-GTCAAG CAGAGCATT-3’，产物长度139 bp；
caspase-3正向5’-TGCAATATGCAGATAC-3’，反向5’-CCGATAAGTAC GATTAG-3’，产物长度266 bp；
β-actin正向5’-TGAC CACGATACGAGC-3’，反向5’-CGACGAGGATACGA TCG-3’，产物长度145 bp。引物均由宝生物工程（大连）有限公司设计合成。
1.2.8 PTEN、Ki-67、caspase-3、活化的caspase-3蛋白表达检测
收集各组细胞，加入RIPA细胞裂解液裂解提取细胞总蛋白，通过BCA法进行蛋白定量。100℃沸水浴10 min。将蛋白样品按照30 μg/孔上样，电泳分离并转膜到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，加入PTEN、Ki-67、caspase-3、活化的caspase-3、β-actin一抗（1∶1 000）4℃培养过夜。次日加入相应二抗（1∶5 000）室温孵育2 h。滴加化学发光试剂（ECL），显影曝光，JP-2880凝胶成像系统成像，以β-actin为内参，应用Image J软件对蛋白条带进行定量分析。
1.2.9 circRNA TCF25与miR-128b的靶向关系分析
通过TargetScan数据库（https：//www.targetscan.org/vert_80/）预测circRNA TCF25的靶基因。采用脂质体转染法将WT circRNA TCF25、MUT circRNA TCF25荧光素酶报告载体分别与miR-128b模拟物、miR-NC共转染至人乳腺癌MCF-7细胞。常规培养48 h后，按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书检测miR-128b mimics组和miR-NC组细胞中circRNA TCF25荧光素酶相对活性。
1.3 统计学分析
采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，符合正态分布的计量资料采用±s表示，2组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 各组细胞circRNA TCF25、miR-128b表达比较
与空白组和si-NC组比，si-circRNA TCF25组细胞circRNA TCF25表达降低，miR-128b表达升高；
pcDNA-circRNA TCF25组细胞circRNA TCF25表达升高，miR-128b表达降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与空白组和miR-NC组比，miR-128b mimic组细胞circRNA TCF25表达降低，miR-128b表达升高；
miR-128b inhibitor组细胞circRNA TCF25表达升高，miR-128b表达降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与pcDNA-circRNA TCF25组比较，pcDNA-circRNA TCF25+miR-128b mimic组细胞circRNA TCF25表达降低，miR-128b表达升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。
表1 各组细胞circRNA TCF25、miR-128b表达比较（±s）Tab.1 Comparison of circRNA TCF25 and miR-128b expression in each group（±s）
表1 各组细胞circRNA TCF25、miR-128b表达比较（±s）Tab.1 Comparison of circRNA TCF25 and miR-128b expression in each group（±s）
1）P＜0.05 vs.blank group；
2）P＜0.05 vs.si-NC group；
3）P＜0.05 vs.miR-NC group；
4）P＜0.05 vs.pcDNA-circRNA TCF25 group.
GroupncircRNA TCF25miR-128b Blank group61.02±0.201.00±0.19 si-NC group60.99±0.191.01±0.18 si-circRNA TCF25 group60.52±0.091），2）1.35±0.241），2）pcDNA-circRNA TCF25 group61.74±0.311），2）0.71±0.121），2）miR-NC group61.00±0.180.98±0.17 miR-128b mimic group60.66±0.121），3）1.93±0.371），3）miR-128b inhibitor group61.42±0.261），3）0.45±0.081），3）pcDNA-circRNA TCF25+miR-128b mimic group61.22±0.204）1.17±0.184）
2.2 circRNA TCF25的鉴定及其亚细胞定位
与对照组比较，Rnase R组circRNA TCF25相对表达量无统计学差异（P＞0.05），而TCF25mRNA相对表达量下降（P＜0.05），见表2。核质分离实验显示，人乳腺癌MCF-7细胞中circRNA TCF25在胞质中的相对表达量（1.65±0.28）高于其在细胞核中的相对表达量（0.61±0.10，P＜0.05）。
表2 circRNA TCF25与TCF25 mRNA表达比较（±s）Tab.2 Comparison of circRNA TCF25 and TCF25 mRNA expression（±s）
表2 circRNA TCF25与TCF25 mRNA表达比较（±s）Tab.2 Comparison of circRNA TCF25 and TCF25 mRNA expression（±s）
1）P＜0.05 vs.control group.
GroupncircRNA TCF25TCF25 mRNA Control61.04±0.200.98±0.19 RNase R60.96±0.18 0.22±0.031）
2.3 各组细胞增殖活力比较
在24 h、48 h、72 h 3个时间点，与空白组和si-NC组比较，si-circRNA TCF25组细胞增殖活力降低，pcDNA-circRNA TCF25组细胞增殖活力升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；
与空白组和miR-NC组比较，miR-128b mimic组细胞增殖活力降低，miR-128b inhibitor组细胞增殖活力升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；
与pcDNA-circRNA TCF25组比较，pcDNA-circRNA TCF25+miR-128b mimic组细胞增殖活力降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图1。
*P＜0.05 vs.blank group；
#P＜0.05 vs.si-NC group；
＆P＜0.05 vs.miR-NC group；
△P＜0.05 vs.pcDNA-circRNA TCF25 group.图1 各组细胞增殖活力比较Fig.1 Comparison of cell proliferation activity in each group
2.4 各组细胞凋亡情况比较
空白组、si-NC组、si-circRNA TCF25组、pcDNAcircRNA TCF25组、miR-NC组、miR-128b mimic组、miR-128b inhibitor组、pcDNA-circRNA TCF25+miR-128b mimic组细胞凋亡率分别为（17.38±2.16）%、（15.22±2.67）%、（43.75±7.98）%、（8.64±1.19）%、（16.16±2.51）%、（38.84±7.43）%、（9.19±1.46）%和（14.45±2.19）%。与空白组和si-NC组比较，sicircRNA TCF25组细胞凋亡率升高，pcDNA-circRNA TCF25组细胞凋亡率降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；
与空白组和miR-NC组比较，miR-128b mimic组细胞凋亡率升高，miR-128b inhibitor组细胞凋亡率降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；
与pcDNA-circRNA TCF25组比较，pcDNA-circRNA TCF25+miR-128b mimic组细胞凋亡率升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图2。
图2 流式细胞术检测各组细胞凋亡率Fig.2 Cell apoptosis rates in each group determined using flow cytometry
2.5 各组细胞PTEN、Ki-67、caspase-3 mRNA表达比较
与空白组和si-NC组比较，si-circRNA TCF25组细胞Ki-67mRNA表达降低，PTEN、caspase-3mRNA表达升高，pcDNA-circRNA TCF25组细胞Ki-67mRNA表达升高，PTEN、caspase-3mRNA表达降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；
与空白组和miR-NC组比较，miR-128b mimic组细胞Ki-67mRNA表达降低，PTEN、caspase-3mRNA表达升高，miR-128b inhibitor组细胞Ki-67mRNA表达升高，PTEN、caspase-3mRNA表达降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；
与pcDNA-circRNA TCF25组比较，pcDNA-circRNA TCF25+miR-128b mimic组细胞Ki-67mRNA表达降低，PTEN、caspase-3mRNA表达升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表3。
表3 各组细胞PTEN、Ki-67、caspase-3 mRNA表达比较（±s）Tab.3 Comparison of PTEN，Ki-67，and caspase-3 mRNA expression in each group（±s）
表3 各组细胞PTEN、Ki-67、caspase-3 mRNA表达比较（±s）Tab.3 Comparison of PTEN，Ki-67，and caspase-3 mRNA expression in each group（±s）
1）P＜0.05 vs.blank group；
2）P＜0.05 vs.si-NC group；
3）P＜0.05 vs.miR-NC group；
4）P＜0.05 vs.pcDNA-circRNA TCF25 group.
GroupnPTEN mRNAKi-67 mRNA Caspase-3 mRNA Blank group60.99±0.181.02±0.200.97±0.17 si-NC group61.00±0.190.98±0.190.98±0.18 si-circRNA TCF25 group61.37±0.221），2）0.59±0.101），2）1.52±0.281），2）pcDNA-circRNA TCF25 group60.62±0.111），2）1.45±0.241），2）0.73±0.131），2）miR-NC group60.97±0.161.00±0.191.03±0.20 miR-128b mimic group61.41±0.261），3）0.67±0.111），3）1.49±0.271），3）miR-128b inhibitor group60.75±0.131），3）1.64±0.301），3）0.54±0.091），3）pcDNA-circRNA TCF25+miR-128b mimic group60.89±0.154）1.14±0.224）0.95±0.174）
2.6 各组细胞PTEN、Ki-67、caspase-3、活化的caspase-3蛋白表达比较
与空白组和si-NC组比较，si-circRNA TCF25组细胞Ki-67蛋白表达降低，PTEN、caspase-3、活化的caspase-3蛋白表达升高；
pcDNA-circRNA TCF25组细胞Ki-67蛋白表达升高，PTEN、caspase-3、活化的caspase-3蛋白表达降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与空白组和miR-NC组比较，miR-128b mimic组细胞Ki-67蛋白表达降低，PTEN、caspase-3、活化的caspase-3蛋白表达升高；
miR-128b inhibitor组细胞Ki-67蛋白表达升高，PTEN、caspase-3、活化的caspase-3蛋白表达降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与pcDNA-circRNA TCF25组比较，pcDNAcircRNA TCF25+miR-128b mimic组细胞Ki-67蛋白表达降低，PTEN、caspase-3、活化的caspase-3蛋白表达升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表4、图3。
1，blank group；
2，si-NC group；
3，si-circRNA TCF25 group；
4，pcDNAcircRNA TCF25 group；
5，miR-NC group；
6，miR-128b mimic group；
7，miR-128b inhibitor group；
8，pcDNA-circRNA TCF25+miR-128b mimic group.图3 各组细胞PTEN、Ki-67、caspase-3、活化的caspase-3蛋白表达Fig.3 PTEN，Ki-67，caspase-3，and cleaved caspase-3 protein expression in each group
表4 各组细胞PTEN、Ki-67、caspase-3、活化的caspase-3蛋白表达比较（±s）Tab.4 Comparison of PTEN，Ki-67，caspase-3，and cleaved caspase-3 protein expression in each group（±s）
表4 各组细胞PTEN、Ki-67、caspase-3、活化的caspase-3蛋白表达比较（±s）Tab.4 Comparison of PTEN，Ki-67，caspase-3，and cleaved caspase-3 protein expression in each group（±s）
1）P＜0.05 vs.blank group；
2）P＜0.05 vs.si-NC group；
3）P＜0.05 vs.miR-NC group；
4）P＜0.05 vs.pcDNA-circRNA TCF25 group.
GroupnPTENKi-67Caspase-3Cleaved caspase-3 Blank group60.55±0.100.83±0.150.62±0.110.20±0.03 si-NC group60.52±0.090.80±0.140.58±0.100.21±0.04 si-circRNA TCF25 group60.78±0.131），2） 0.62±0.111），2）0.83±0.151），2）0.54±0.091），2）pcDNA-circRNA TCF25 group60.42±0.071），2）1.09±0.191），2）0.45±0.081），2） 0.11±0.021），2）miR-NC group60.49±0.080.85±0.160.63±0.120.23±0.04 miR-128b mimic group60.66±0.121），3）0.57±0.101），3） 0.94±0.161），3）0.60±0.111），3）miR-128b inhibitor group60.37±0.061），3）1.14±0.211），3）0.40±0.071），3）0.09±0.011），3）pcDNA-circRNA TCF25+miR-128b mimic group60.59±0.104）0.77±0.134）0.68±0.124）0.24±0.044）
2.7 circRNA TCF25与miR-128b的靶向关系分析
TargetScan数据库分析发现，miR-128b与circRNA TCF25存在结合位点，提示miR-128b可能是circRNA TCF25的靶基因，见图4。在转染WT circRNA TCF25细胞中，miR-128b mimic组细胞相对荧光强度低于miR-NC组细胞，差异有统计学意义（P＜0.05）；
在转染MUT circRNA TCF25细胞中，miR-128b mimic组和miR-NC组细胞相对荧光强度差异无统计学意义（P＞0.05），见图4。
图4 circRNA TCF25与miR-128b结合位点及各细胞相对荧光强度Fig.4 CircRNA TCF25 and miR-128b binding sites and relative fluorescence intensity in cells
目前乳腺癌的发病机制尚不清楚。普遍认为乳腺癌的发生是体内外多种因素（包括遗传、高龄、肥胖、高脂肪饮食、月经初潮早、首次妊娠晚、抽烟酗酒等）共同作用的结果［7］。临床上治疗乳腺癌以手术治疗为主，辅以放化疗、内分泌治疗等综合治疗策略，但患者存在不良反应多、复发转移率高等问题。近年来，分子靶向药物的出现为乳腺癌的临床治疗提供了新思路，因此探究乳腺癌新的分子靶点对乳腺癌治疗意义重大。
circRNA是近年来发现的，它广泛存在于真核细胞内，结构较为稳定，基因序列高度保守［8］。众多研究［9-11］发现，circRNA可通过竞争性结合miRNA来解除miRNA对靶基因表达的抑制作用，在人类多种疾病的发生发展过程中发挥作用。王敏等［12］研究显示，circRNA TCF25可通过靶向抑制miR-103a-3p/miR-107表达，促进细胞分裂蛋白激酶6（CDK6）的表达，进而在膀胱癌的增殖和迁移中发挥促进作用。LI等［13］发现，过表达circRNA TCF25可通过降低miR-206的水平促进骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭。本研究结果显示，与未经RNase R酶处理的对照组相比，circRNA TCF25的相对表达量在RNase R酶处理后无明显变化，而线性TCF25的相对表达量在经RNase R酶处理后降低，且circRNA TCF25在胞质中的相对表达量高于细胞核，验证了circRNA TCF25的环状特性，且证实了其主要定位于胞质。miR-128被认为是一种具有抑癌和促癌双面功能的miRNA，通常情况下发挥抑癌基因的作用，同时具有调节细胞增殖、凋亡和耐药等作用［14］。LIU等［15］指出，长链非编码RNA浆细胞瘤变异易位1（PVT1）可通过靶向抑制miR-128的表达诱导乳腺癌细胞的上皮-间质转化、增殖和转移，参与乳腺癌的进展。本研究中，与空白组和si-NC组比较，si-circRNA TCF25组细胞增殖活力降低，凋亡率升高；
pcDNA-circRNA TCF25组细胞增殖活力升高，凋亡率降低。与空白组和miR-NC组比较，miR-128b mimic组细胞增殖活力降低，凋亡率升高；
miR-128b inhibitor组细胞增殖活力升高，凋亡率降低。与pcDNA-circRNA TCF25组比较，pcDNA-circRNA TCF25+miR-128b mimic组细胞增殖活力降低，凋亡率升高，提示circRNA TCF25可促进人乳腺癌细胞MCF-7增殖，抑制其凋亡；
而miR-128b能够抑制人乳腺癌细胞MCF-7增殖，促进其凋亡。而且上调miR-128b表达能够逆转过表达circRNA TCF25对人乳腺癌细胞MCF-7增殖、凋亡的影响，与以往研究结果一致。
本研究还发现，与空白组和si-NC组比较，si-circ-RNA TCF25组细胞Ki-67表达降低，PTEN、caspase-3、活化的caspase-3表达升高；
pcDNA-circRNA TCF25组细胞Ki-67表达升高，PTEN、caspase-3、活化的caspase-3表达降低。与空白组和miR-NC组比较，miR-128b mimic组细胞Ki-67表达降低，PTEN、caspase-3、活化的caspase-3表达升高；
miR-128b inhibitor组细胞Ki-67表达升高，PTEN、caspase-3、活化的caspase-3表达降低。与pcDNA-circRNA TCF25组比较，pcDNA-circRNA TCF25+miR-128b mimic组细胞Ki-67表达降低，PTEN、caspase-3、活化的caspase-3表达升高，提示circRNA TCF25有促进Ki-67的表达，抑制PTEN、caspase-3、活化的caspase-3表达的作用，而miR-128b的作用与circ-RNA TCF25相反，且上调miR-128b表达能够逆转过表达circRNA TCF25对人乳腺癌细胞MCF-7增殖、凋亡相关基因蛋白表达的影响。PTEN是一种具有特异性磷酸酯酶活性的抑癌基因，具有抑制肿瘤细胞生长增殖、诱导细胞周期阻滞和促进细胞凋亡等多种功能。相关研究［16］显示，PTEN在多种肿瘤细胞中表达水平降低。caspase-3是细胞凋亡中的最后执行因子，当细胞受到凋亡信号刺激时caspase-3活化，活化的caspase-3通过酶切割特异性底物、DNA修复相关分子及细胞骨架蛋白等促进细胞凋亡［17］。Ki-67是一种核蛋白，表达于细胞生长发育的各个周期，能反映组织细胞的增殖活性［18］。马兆霞［19］指出，miR-128可通过激活PTEN信号通路参与调控子宫内膜癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移等细胞生物学行为；
MA等［20］研究显示，miR-128b可通过促进caspase-3表达促进大脑中动脉闭塞大鼠脑组织细胞凋亡。LIANG等［21］发现，miR-128可通过下调Ki-67在胃癌细胞中的表达抑制胃癌细胞的生长，提高化疗敏感性。双荧光素酶实验结果证实了circRNA TCF25可靶向调控miR-128b，因此合理推测circRNA TCF25可能是通过靶向抑制miR-128b的表达，调控其下游的细胞增殖、凋亡相关基因表达来发挥促进人乳腺癌细胞MCF-7增殖，抑制其凋亡作用的。
综上所述，circRNA TCF25可能是通过靶向抑制miR-128b表达，促进Ki-67表达，抑制PTEN、caspase-3、活化的caspase-3表达，发挥促进人乳腺癌细胞MCF-7增殖，抑制其凋亡作用的。本研究初步阐释了circ-RNA TCF25对人乳腺癌细胞MCF-7增殖、凋亡的影响及可能作用机制，为乳腺癌的临床治疗提供了潜在靶点。
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