玛依奴尔·阿塔吾拉, 吴 龙,2, 阿尔曼·阿卜力孜, 赵 今,2
(1新疆医科大学第一附属医院 (附属口腔医院) 牙体牙髓病科; 2新疆维吾尔自治区口腔医学研究所, 乌鲁木齐 830054)
龋病是最常见的口腔疾病,可影响儿童、青少年、成人以及老年人所有年龄段人群的口腔健康及生活质量[1-4]。变异链球菌(Streptococcusmutans,S.mutans)是口腔致龋的主要病原菌, 在龋齿的发生和发展中起着核心作用,因此抑制S.mutans及菌斑生物膜的形成对于预防龋齿,促进口腔健康至关重要[5-6]。天然药物及其提取物已成为预防治疗口腔疾病的研究热点[7], 目前已被证实含有防龋成分的天然药物包括厚补、 蜂胶、 苦参等[8-9]。桑白皮(MoriCortex)别名桑根皮、桑根白皮、桑皮等,用药历史悠久,本课题组前期体外研究发现新疆桑白皮提取物能够抑制主要致龋细菌浮游状态下的生长、产酸、产糖及黏附能力,还对生物膜的形成有一定的抑制作用[10]。本研究采用龋病动物模型评估新疆桑白皮提取物防龋作用的有效性及安全性,现报道如下。
1.1 仪器与试药SW-CJ-2FD超净工作台(上海博迅科技有限公司);MCO-15AC 37℃恒温培养箱(日本三洋公司);TCS-SP8激光共聚焦荧光显微镜 (德国徕卡公司);新疆桑白皮药材(由新疆医科大学天然药物重点实验室提供, 经鉴定符合《中华人民共和国药典》2020版规定); 氯己定 (Chlorhexidine,CHX, 上海源叶生物科技有限公司, 55-56-1);紫脲酸铵(上海源叶生物科技有限公司, 3051-09-0);罗丹明 B(索莱宝生物科技有限公司,81-88-9)。
1.2 实验动物42只21 d 龄雄性SPF-SD大鼠,购自新疆医科大学动物实验中心,本研究通过新疆医科大学实验动物伦理委员会审批(批号: IACUC-20230627-12)。
1.3 致龋菌及培养基变异链球菌(Streptococcusmutans,S.mutans,广东省微生物培养中心,UA159);脑心浸液培养基(Brain-Heart Infusion, BHI,北京索莱宝科技有限公司, 315G032); 轻唾杆菌肽琼脂(Mitis Salivarius Bacitricin Agar, MSBA,山东拓普生物工程有限公司, M0740)。
1.4 新疆桑白皮提取物及S.mutans菌悬液的制备取新疆桑白皮药材适量粉碎过60目筛,按照料液比1∶10(g/mL)用80%乙醇回流提取3次,合并滤液旋转蒸发浓缩并冷冻干燥(-80℃),得到粉末,粉末用含1%DMSO的BHI培养基配制浓度为16 g/L的母液,经无菌滤器过滤除菌,按倍比稀释法将母液用蒸馏水分别稀释至1.0、0.5、0.25 g/L,置于4℃环境备用。选取S.mutans冻存菌株接种于BHI培养基,37℃培养48 h。观察菌落生长形态,随机取单个菌落涂片镜检,无污染且生化鉴定为纯培养后,相同培养条件下培养48 h,取形态一致的菌落溶于BHI液体培养基,采用麦氏比浊法标定菌悬液浓度至1×106CFU/mL。
1.5 实验方法
1.5.1 实验分组 取42只21 d 龄雄性SPF-SD大鼠,采用随机数表法随机分为6组:新疆桑白皮提取物高、中、低剂量组(1.00、0.50、0.25 g/L新疆桑白皮提取物),阳性对照组(0.12%的氯己定,CHX组);阴性对照组(无菌蒸馏水,CA组);空白对照组(不建模不干预,Control组)。饲养于新疆医科大学动物中心,标准环境,给予12 h 的光/暗循环。
1.5.2 龋齿动物模型的建立 参照符合国际Keyes龋病动物模型标准,除Control组其他5组于鼠龄22～24 d进行内源性抑菌,饲以均匀混有氨苄西林钠(每2 g配1 000 g普通饲料)的饲料,含青霉素钾(80万单位,1瓶配 200 mL生理盐水)的饮水[11]。鼠龄25 d起大鼠饲以Diet 2000# 致龋饲料(南通特洛菲饲料科技有限公司)及5%蔗糖水;鼠龄25 d,口腔拭子检测抑菌效果。鼠龄26～28 d,各组分别用无菌棉签浸以1×106CFU/mL 浓度S.mutans菌悬液接种于35只大鼠口腔 (500 μL/只)。鼠龄29 d , 所有大鼠取口腔拭子检测定菌效果。Control组饲以常规饲料及无菌蒸馏水。
1.5.3 药物干预 鼠龄30～50 d , 用无菌棉签蘸各组对应实验药液 (1 mL/只) , 分别涂于大鼠磨牙各牙面及口腔黏膜(15 s/象限),余液注入口腔,以确保药液充分发挥作用。2次/d(每天8点、20点),连续21 d。始终由同一人完成干预,干预结束后禁食禁水30 min,每日称重监测大鼠的健康状况。
1.5.4 样本收集 鼠龄51 d 各组大鼠用10%水合氯醛麻醉,行腹主动脉取血后,给予安乐死。无菌解剖颌骨组织,编号后置于包埋盒内,高压蒸汽灭菌(121℃,15 min),去除颌骨周围附着的牙龈等软组织,左侧上下颌磨牙标本用于Keyes评分,右侧上下颌磨牙标本用于CLSM。取各组大鼠心、肝、脾、肺和肾等脏器,剥除脏器表面系膜,冰盐水冲洗,用盐水浸湿纱布拭去多余水分,称重并记录(精确至0.1 g),取口腔同侧5 mm×5 mm颊黏膜,以上组织编号后于4%多聚甲醛溶液固定保存,用于HE染色。
1.6 指标的测定及评价
1.6.1S.mutans水平的测定 分别在鼠龄29、36、43及50 d 时采集各组大鼠口内及磨牙牙面菌斑拭子,用BHI液体培养基倍比稀释 (1∶1 000为稀释梯度) , 取10 μL均匀涂于BHI琼脂培养基 (总菌菌落数) 及MSBA培养基(S.mutans菌落数), 37℃厌氧培养12 h, 由两人分别进行菌落计数,计算S.mutans水平=(S.mutans菌落数/总菌落数)×100%。比较各组间菌落水平,评价新疆桑白皮提取物对龋病的防治是否有效。
1.6.2 Keyes评分 取各组大鼠左侧颌骨,冲洗干净后用0.4%紫脲酸铵溶液中避光染色18 h,龋损处被紫脲酸胺染成红色,紫脲酸铵渗入大鼠磨牙的范围和深度作为龋损的进展范围和严重程度。根据改良Keyes评分法[11-13]:龋齿进展为E级(釉质表层)、Ds级(牙本质浅层)、Dm级(牙本质中层)以及Dx级(牙本质深层)4个级别,用体式显微镜成像后,对磨牙光滑面龋损进行计分;将大鼠磨牙沿近远中矢状面切开暴露主沟,对窝沟龋损评分,评定不同药物的抑龋情况。
1.6.3 CLSM检测 取各组大鼠右侧鼠磨牙沿牙冠近远中矢状面切割制成300 μm的牙磨片,37℃避光浸泡于0.1 mmol/L罗丹明B荧光染料24 h,采用CLSM观察牙磨片的荧光情况,龋损程度越严重,穿透过牙磨片的染料越深,则荧光强度亦愈强。
1.6.4 大鼠体重及健康状况的记录 实验期间定时测量各组大鼠体重,检查大鼠的食物摄入量,注意大鼠毛发的光泽度等外观特征,以此来判断其健康状况。
1.6.5 脏器系数的测定 取大鼠主要脏器(心、肝、脾、肺、肾),通过公式计算大鼠脏器系数,脏器系数=脏器重量/大鼠体重×100%。
1.6.6 HE染色 取各组大鼠主要脏器及颊黏膜行HE染色,显微镜下呈像,观察组织结构有无改变。
1.7 统计学处理采用SPSS26.0统计学软件,实验数据若满足正态性和方差齐性,采用单因素方差分析,采用LSD法进行两两比较;非正态分布采用Kruskal-Wallis秩和检验,检验水准α=0.05。
2.1 各组大鼠S.mutans水平的比较鼠龄29 d, 与CA组比较,各实验组S.mutans水平差异无统计学意义(P>0.05), 提示各组均成功接种了S.mutans菌悬液[14]。鼠龄36、43 d,与CA组比较,新疆桑白皮提取物高剂量组S.mutans水平降低,差异无统计学意义(P>0.05)。鼠龄50 d, 与CA组比较,新疆桑白皮提取物高、中剂量组S.mutans水平降低,差异有统计学意义(P<0.05),见图 1。
注：
鼠龄29、50 d的数据记为平均值±标准差鼠龄36、45 d的数据记为中位数(IQR)。与桑白皮高剂量组比较,aP<0.05; 与桑白皮中剂量组比较, bP<0.05; 与桑白皮低剂量组比较, cP<0.05; 与CHX组比较, dP<0.05; 与CA组比较, eP<0.05。
2.2 各组大鼠Keyes评分比较CA组磨牙光滑面及窝沟处的颜色改变较其他各组更明显,见图2。与CA组比较,新疆桑白皮提取物高、中剂量组磨牙光滑面及窝沟处各级龋损Keys评分均降低,新疆桑白皮提取物低剂量组磨牙光滑面、E级、Ds级、Dm级评分均降低,差异有统计学意义(P<0.05),见图3。
注: 不同颜色的箭头指向不同程度的龋损;X线片红色箭头记为龋损。
注：
Surface: 光滑面龋; E: 釉质龋; Ds: 牙本质浅层龋; Dm: 龋损程度在牙本质深度的3/4以内; Dx: 龋损程度在牙本质深度的4/3或全层。Surface、E、Ds、Dm 数据记为平均值±标准差数据记为中位数(IQR)。与桑白皮高剂量组比较,aP<0.05; 与桑白皮中剂量组比较, bP<0.05; 与桑白皮低剂量组比较, cP<0.05; 与CHX组比较, dP<0.05; 与CA组比较, eP<0.05。
2.3 各组大鼠牙磨片CLSM检测在CA组牙磨片中可观察到釉质连续性中断,荧光强度及渗透深度均比其他组强,见图4A。与CA组比较,桑白皮高剂量组和CHX 组渗透入釉质或牙本质的荧光量降低,差异有统计学意义(P<0.05),见图4B。
注：黄色箭头表示因龋损产生的牙釉质表面凹坑及孔隙增宽后的荧光渗透。与桑白皮高剂量组比较,aP<0.05; 与桑白皮中剂量组比较, bP<0.05; 与桑白皮低剂量组比较, cP<0.05; 与CHX组比较, dP<0.05; 与CA组比较, eP<0.05。
2.4 各组大鼠体重及健康状况在实验过程中,各组大鼠健康状况良好, 无死亡个体, 大鼠体重的生长趋势相似,见图5。
图5 干预期间各组大鼠体重变化图
2.5 各组大鼠脏器系数比较与CA组比较,新疆桑白皮提取物中剂量及CHX组心脏脏器系数增大,差异有统计学意义(P<0.01),见图6。
图6 各组大鼠脏器系数比较
2.6 各组大鼠主要脏器及颊黏膜HE染色情况各组大鼠主要脏器及颊黏膜HE染色切片均匀,组织学结构未见明显改变,见图7。
图7 各组大鼠主要脏器及颊黏膜HE染色图(×10倍)
目前已有多种天然药材被证实具有防龋效果,桑白皮是一种具有悠久用药历史的天然药材,在多个文献中提到具有抗菌抗炎的功效[15-18]。但其在口腔健康领域的应用探究还未见报道。因此,本研究在前期实验的基础上通过动物实验进一步验证了新疆桑白皮提取物防龋有效性及安全性。
氯己定是为一种广谱杀菌剂,浓度在0.12%～2%的氯己定溶液常被用于口腔疾病的防治,且治疗效果显著[19-20], 因此本实验选择浓度为0.12% CHX溶液作为阳性对照组的用药。
根据唾液S.mutans水平的测定结果,提示新疆桑白皮提取物在一定程度上具有抑制S.mutans繁殖的潜力,但低剂量的新疆桑白皮提取物抗龋效果欠佳。结合Keyes评分结果,高、中剂量组新疆桑白皮提取物能有效降低光滑面及窝沟各级龋损,但效果不及氯己定,以上结果同CLSM观察结果一致。心脏脏器系数结果显示,与CA组比较,新疆桑白皮提取物中剂量组及CHX组心脏脏器系数增大,考虑是因为大鼠水合氯醛麻醉后腹主动脉取血安乐死时, 大鼠心脏内部分血液未完全流出, 致组间脏器重量有差异。而在整个实验过程中,新疆桑白皮提取物未表现出明显的毒副作用。
综上所述,新疆桑白皮提取物具有一定的抗龋作用,且毒副作用低,具有成为抗龋剂的潜力,为新疆桑白皮提取物的开发和利用提供了理论基础。
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