肖兴玉,刘世博,张莹辉,王 楠,李俊平,徐 磊*
(1.中国兽医药品监察所/国家动物布鲁氏菌病参考实验室,北京 100081;2.吉林大学动物科学学院,吉林长春 130062;3.吉林农业大学动物医学院,吉林长春 130118)
布鲁氏菌病(Brucellosis,简称布病)是由布鲁氏菌(Brucella)侵染机体后所引起的一种急性或慢性人兽共患传染病[1-2]。布鲁氏菌自1887年被首次分离后布病迅速蔓延至全球170多个国家和地区,遍布于亚洲、非洲、欧洲、大洋洲和拉丁美洲,严重威胁公共健康和畜牧业发展[3]。据世界卫生组织(World Health Organization,WHO)报道,全球每年有超50万人被确诊为布病感染者,实际发病率应为该数字的10～25倍[4]。同时,仅在我国,牲畜患布病每年所造成的经济损失便高达713亿元。2005年,世界动物卫生组织(World Organization for Animal Health,WOAH)将布病列为B类法定传染病,我国将其列为二类传染病[5-6]。
1985年,WHO根据宿主类型,将布鲁氏菌属分为6个种(羊种、绵羊型副睾种、牛种、猪种、沙林鼠种和犬种)和19个生物型[7]。目前已发现的猪布鲁氏菌有5个生物型, 其中1、2、3型可以引起猪发病,4、5型可引起其他动物发病[8-9]。猪肉作为全球消费量最大的饲养动物肉类,在提供动物蛋白上起着十分关键的作用。因此,猪在全球尤其是发展中国家的畜牧生产中,占据重要地位。而猪布病作为威胁猪养殖业发展的主要疾病之一,对其进行有效的预防与诊断,具有十分重要的意义。
1.1 传染源
主要指患病母猪的流产胎儿、乳汁、胎衣、胎水等分泌物,还可通过污染水源、饲料、饲养用具、感染健康牲畜。患病公猪的精液同样有致病性,可通过交配或人工授精感染母猪[5,8]。
1.2 传染方式
主要通过3种方式进行传播。(1)通过消化道进行传染,即牲畜食用污染过的饲料和水源进行传染;(2)通过皮肤黏膜、呼吸道、损伤或未损伤的皮肤、结膜进行传染;(3)通过交配进行传播;有时吸血昆虫也可传播此疾病[8-10]。
1.3 流行特点
本病一般为散发,性成熟年龄猪群易感,产仔季为多发季节。母猪感染后一般只发生1次流产,流产2次的较为少见[8,10]。
1.4 流行情况
1914年,从印第安纳州的流产猪胎中首次分离出猪布鲁氏菌,这是关于猪布病的最早记载。但由于20世纪初微生物学发展的局限性,直至1929年,该分离株才被认定为独立的猪布鲁氏菌。此后,猪布病在世界范围内蔓延开来,并在野生动物群体尤其是野猪中广泛流行,但猪布病不同生物型的流行情况却存在较大差异。
在美国,预计有600万头野猪患有1型或3型猪布鲁氏菌病,猪布病的高流行率所导致的疾病传播,不仅是在家猪群体中,还严重影响了牛的养殖[11];在欧洲,分离出1型猪布鲁氏菌的记载极少,3型猪布鲁氏菌仅在克罗地亚有过报道,主要是以褐兔为宿主的2型猪布鲁氏菌传播为主[5,11];在中国,虽然以3型猪布病零星暴发的情况为主,却仍然会造成严重的经济损失[5,11];在非洲、南美洲、东南亚,关于猪布病的流行病学数据有限,但都有分离到猪布鲁氏菌1型的相关记载。尽管在各国制定的猪布病防控措施下,有效地降低了该病在家猪中的流行率,但近5年来,在德国、法国、澳大利亚、塞尔维亚、意大利、埃及、巴西等国家的流行病学调查中,均有检出猪布病的相关报道[12-18]。
母猪患病后,最典型的症状为流产。一般在怀孕第2、第3个月,流产情况最为明显,个别患病母猪也会在妊娠第2周、第3周出现流产症状。流产胎儿,多数为死胎。有时因胎衣不下,还会伴发子宫内膜炎,影响后期配种。由于流产前症状不明显,且早期有流产状况出现时,胎儿、胎衣常被母猪吃掉,而使猪布病不易被发现。此外,母猪感染,重复流产的情况较为少见[9]。
公猪患病后,最典型症状为睾丸发炎和附睾炎。患病公猪睾丸有热痛感,表现为一侧或两侧睾丸肿大,严重的会发生睾丸萎缩甚至硬化,影响性欲,失去配种能力。
除上述表现症状之外,无论是患病公猪,还是患病母猪,都可能产生以下症状。免疫系统发挥作用,出现高热;食欲减退,体重下降;出现呕吐、腹泻等不良反应;出现呼吸困难、气喘等症状;出现关节炎、关节肿胀和疼痛的症状,常见在后肢。受此影响,病猪会出现行走不便、跛行等现象[11,19]。
猪布病诊断方法主要有3种,分别是病原学方法、免疫学方法和分子生物学方法[20]。根据世界动物卫生组织的相关规定,需要将所有猪的流产和睾丸炎病例均视为布鲁氏菌病,同时还应观察是否有胎衣滞留、关节炎、腹泻等布病临床相关症状。然后辅以流行病学调查,通过实验室诊断方法进行最终确诊。但猪布病早期临床症状不明确,使猪布病不易被发现,只能通过分离和鉴定布鲁氏菌才能得到明确诊断,除此之外,没有任何一种单一的检测方法可以将一种细菌明确鉴定为布鲁氏菌。因此,为了准确鉴别,通常需要结合生长特征、免疫学、病原学或分子方法进行联合诊断。
3.1 病原学方法
细菌培养鉴定作为猪布病诊断的“金标准”,是最精确也是最直接的诊断方法[21]。所以在有实验条件的情况下,应以病原培养鉴定为唯一标准,尽可能的进行,以鉴别疾病和确定所涉及的猪布病的生物型。对猪布鲁氏菌进行培养时,通常使用TSB培养基或Farrell氏培养基,对患病猪的乳腺、妊娠或产后子宫、精液样本、流产胎儿样本进行培养[22]。但培养鉴定法在使用时,对实验室等级和实验人员有严格要求,同时还存在耗时长、分离率低、安全隐患高的缺点,极大地制约该方法的实际应用。
此外,布鲁氏菌作为一种革兰氏阴性菌,具有抵抗弱酸脱色的特性,可通过Ziehl-Neelsen染色法对猪布病进行初步鉴别[23]。同时,无论是Braun &Bonestell的结晶紫菌落染色法或Henry的斜反射光外观鉴定法,还是直接观察菌落形态、生长特性、使用脲酶和氧化酶试验进行鉴别,都只能作为猪布鲁氏菌病存在的假定证据,所以无论检测结果是阳性还是阴性,都应通过培养进行确认。
3.2 免疫学方法
3.2.1 血清凝集试验 试管凝集试验(SAT)作为早期一种经典的血清凝集试验方法,具有敏感性高、可定性定量、检出率高的优点,是我国官方指定布病诊断方法[24]。但由于SAT不适用于现场诊断,特异性容易受猪血清中非特异抗体IgM的影响,造成假阳性结果。在欧美等国家,SAT逐渐被虎红平板凝集试验(rose bengal test,RBT)、缓冲平板凝集试验(buffered plate agglutination test,BPAT)所替代。虎红平板凝集试验与试管凝集试验相比,受特异性凝集干扰小,常被用于全球贸易中猪布病的初筛[3,20]。
参考WOAH对虎红平板凝集抗原的制备方法,虎红平板凝集抗原是对死亡的流产杆菌S99或S1119-3细胞沉淀离心后,使用孟加拉玫瑰染料进行染色,溶于乳酸形成的粉红色液体。RBT检测效果相比SAT有所提高,仍存在特异性不高,检测结果易受样品质量影响、凝集现象不明显,易漏检的问题。对于RBT检测为阳性的样本,还需通过其他手段检测为阳性,才可最终判定为阳性。
补体结合试验(complement fixation test,CFT)作为WOAH推荐的布病诊断方法,可用于羊布病和牛布病的诊断,不可单独用于猪布病的诊断。这是由于对猪进行检测时,猪补体与豚鼠补体相互作用,会降低检测敏感性,无法排除假阳性,故常作为RBT的补充试验[25]。
3.2.2 酶联免疫吸附试验 酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)作为一种灵敏度高、特异性好、操作简便、检测成本低、可定性定量的免疫学检测方法,自1971年Engvall和Perlmann发明ELISA技术后,就被迅速应用到各种抗原和抗体的测定[26]。1976,Garin-Basuji等年首次将ELISA方法应用于布鲁氏菌抗体的检测,并发现检测灵敏度是SAT的10～100倍[27]。目前,关于猪布病已有非常成熟的ELISA诊断体系,其中在布病诊断方面应用最多的是间接ELISA(iELISA)和竞争ELISA(cELISA)。
抗原的选择直接决定着ELISA的灵敏性和特异性,iELISA以光滑型布鲁氏菌的脂多糖O-链结构为包被抗原,对待测抗体进行检测,第二抗体多为商品化的辣根过氧化物酶标记的抗IgG重链表位的单克隆抗体。酶与底物相互作用后,如有明显颜色变化,则证明有布鲁氏菌的存在。由于进行iELISA时,是以检测多糖O-链的抗体为基础,但有一些细菌,如猪普遍感染的耶尔森氏菌O∶9,有类似的脂多糖O-链,在检测中极易造成误检。同时,iELISA还无法对自然感染和接种疫苗所产生的抗体进行鉴别,但对猪布病进行大规模筛查时,仍是一种极为有效的鉴别方法。
为解决耶尔森氏菌O∶9所导致的检测假阳性和无法判断抗体产生原因的问题,实验人员发明了cELISA,即待测游离抗原与固定于载体上的抗原一起竞争相同的抗体。cELISA鉴别的关键在于所使用的抗体,亲和力介于疫苗和自然感染所产生的抗体之间,针对脂多糖O-链特异表位的单克隆抗体。1990年,Macmillan A P首次使用cELISA对牛布病进行诊断,结果表明,该方法不仅可对耶尔森氏菌O∶9进行鉴别,还可对布病疫苗和自然感染进行区分[28]。cELISA的敏感性低于iELISA,但高于RBT,在检测疫苗接种猪和假阳性样品时,特异性高于iELISA和RBT。因此,cELISA更适用于对高患病率猪群进行检测。但无论是iELISA还是cELISA,都存在重现性不好、实验要求多,无法对多种病菌同时检出的缺点,因此有时需同时使用其他检测方法进行辅助诊断。
3.2.3 荧光偏振检测法 荧光偏振检测法(fluorescence polarization assay,FPA)是由Nielsen和Gall发明的一种基于分子旋转特性,对抗原抗体相互作用进行检测的诊断技术。FPA分为试管法和玻片法,检测原理是对分子质量为22 ku的布鲁氏菌进行荧光染料标记,该染料可被相应的平面偏振光所激发。分子大小是影响分子在溶液中旋转速率的关键因素。当存在布鲁氏菌抗体时,荧光标记的抗原与抗体特异性结合,导致抗原分子质量增大,进而使旋转速率(偏振值)减小,速率减小程度可通过荧光偏振仪进行测定[29-30]。同时,FPA作为一种同质分析,无需对检测样本进行分离,只需在每次检测时进行空白或背景读取,因此均有简便快捷的优点。
Nielsen等使用FPA和其他4种检测方法(iELISA、cELISA、CFT、BPAT)同时对14 431份布鲁氏菌血清样本进行检测,结果表明,无论检测阴性样本还是阳性样本,FPA检测准确性均高于其他检测方法[30]。任燕斌等[31]同时使用FPA、iELISA及cELISA对牛布鲁氏菌血清样本进行检测,结果证明FPA的特异性最高,为100%。FPA对猪布病进行检测时,也可以去除大部分由耶尔森氏菌O∶9所造成的非特异性抗体。FPA因具有准确性高,特异性强,简便快速 成本低的优点,是《陆生动物诊断试验和疫苗手册》所指定的检测手段,在猪布病检测方面发挥着重要作用。但FPA不能完全消除由于疫苗接种产生的残留抗体的影响,所以与所有其他血清学检测一样,阳性反应应采用适当的验证手段进行调查。
3.2.4 免疫胶体金技术 自1875年法拉第发现可从氯金酸水溶液中制备胶体金后,免疫胶体金技术(immune colloidal gold technique,GICT)便应具有标志物稳定、应用范围广、检测结果可视化的特点,被迅速应用于大规模的传染病初筛和现场检测。GICT是以胶体金为显色标志物,利用抗原抗体特异性结合的免疫学原理,所发展起来的一种新型免疫标记检测技术。
Kim等建立了对犬种布鲁氏菌的进行检测的GICT方法,并与细菌培养鉴定法和凝集试验进行对比,结果表明GICT拥有等同的敏感性和特异性[32]。孔玉方等[33]利用布鲁氏菌OMP22和OMP28的混合蛋白作为诊断抗原,发明了一种可对布病进行特异性检出的胶体金快速检测试纸条。目前,在我国,应用GICT对包括猪布病在内的各种布病的检验尚无完整的法律法规,因此相关的诊断技术尚未被广泛应用,具有极大的研究前景。
在免疫学领域,除了上述提及的血清凝集试验、酶联免疫吸附试验、荧光偏振检测法、免疫胶体金技术以外,免疫组化法、变态反应中的布鲁氏菌皮肤试验、沉淀试验、乳汁环状试验可能不适用于猪布病检测,但在其他样本的布鲁氏菌检测中发挥着关键作用。对疫苗接种和自然感染所产生的布鲁氏菌抗体进行区分,以及对耶尔森氏菌O∶9造成的假阳性进行鉴别一直是布病血清试验中普遍存在的两个关键问题,因此任何一种免疫学方法对样本检测呈阳性时,都应使用其他方法对阳性结果进行验证。
3.3 分子生物学方法
聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)一经发明,就因高特异性和高灵敏性被应用于人类生活的方方面面,尤其在病原体检测上应用最为广泛。待测基因的选择直接决定着PCR检测能否成功,检测结果是否可信。IS711作为布鲁氏菌所特有的基因,是布病诊断中最常用的基因,per和bcsp313也可用于布病检测。1994年,Bricher B J等[34]首次建立了布鲁氏菌的PCR检测方法(AMOS-PCR)。AMOS-PCR只能鉴别1型猪布鲁氏菌,无法对2、3、4型猪种布鲁氏菌进行区分。此外,PCR扩增后,需通过凝胶电泳进行结果判读,在电泳过程中,极易造成气溶胶污染,产生假阳性。荧光定量PCR (qPCR)通过对荧光信号的采集,即可对检测结果进行判断,相比于普通PCR,具有定性定量,简单快捷,可减少气溶胶污染的优点。Kaden R等[35]开发了一种实时荧光定量PCR技术,可用于特异检测布鲁氏菌的所有生物变种。此外,核酸探针技术、单核苷酸多态性分析(SNP)、环介导等温核酸扩增(LAMP)、微滴式数字PCR(ddPCR)、基因芯片等分子生物学技术均可用于包括猪布病在内的布病诊断。如Liu J Y等[36]使用ddPCR对人血中的布鲁氏菌进行检测,检测灵敏度达1.87拷贝;Shukla J L等[37]开发了一种针对布鲁氏菌bcsp31基因的快速、有效、灵敏的LAMP PCR检测方法,可以在35 min内通过目视检测到低至8 fg的DNA。分子生物学的检测原理不同于免疫学的抗原抗体相互结合,是从基因水平上对待测样本进行鉴别,因此不受到耶尔森氏菌O∶9的影响。同时,针对免疫学上无法对野毒感染和疫苗接种进行区分的问题,在分子生物学上也可得到有效解决。目前,猪群接种的猪布病疫苗多为减毒活疫苗,即细菌的毒力基因或免疫逃逸基因发生缺失。使用多重荧光定量PCR检测时,可同时对猪布鲁氏菌的毒力缺失基因和保守基因进行检测,若缺失基因和保守基因均有明显扩增曲线,则为自然感染,只有目标基因扩增时,为疫苗接种感染。
对布鲁氏菌病进行预防的最好方式便是对牲畜定期接种疫苗.用于牛的S19和RB51疫苗株和用于羊的Rev.1疫苗株是国际上用于布病诊断的主要疫苗株[3]。目前我国所使用布病疫苗多为活疫苗, 分别是A19疫苗株、M5疫苗株、S2疫苗株。A19疫苗株主要用于牛,20世纪70年代后广泛用于我国的牛布病预防。M5株疫苗主要用于羊,近年来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所以M5-90株为亲本株,研制了M5-90∆ 26株,使用配套的ELISA(bp26)检测方法可以实现鉴别诊断。S2株是中国兽医药品监察所研制的,分离自流产母猪,在我国广泛应用与羊和牛的疫苗株,也可以用于猪布病的免疫,是世界上唯一一个可以用于免疫猪的疫苗。S2疫苗株具有给药途径多,口服使用安全,不易感染人等优点。但S2疫苗株免疫持续时间短,需要每年定期接种[38]。
除接种疫苗以外,还可通过以下措施对猪布病进行预防。(1)对猪群进行定期检疫,如发现可疑患病猪,应立即进行隔离扑杀;(2)对猪场进行定期消毒,尤其是出现过流产胎儿的猪场;(3)培养健康种猪,在2月龄和在4月龄各检疫1次;(4)对病猪进行严格的无害化处理。
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