谢清华 吴小凤 陈韵妍
随着我国经济的发展，人民的生活水平日益提高，各类食品的质量和品种也不断焕然更新。然而，近年来食品安全问题屡见不鲜，尤其是微生物安全问题严重令人担忧，由食品微生物引起的安全问题更是严重且迅速，部分病原微生物引发的疾病甚至具有传染性。面对微生物带来的巨大隐患，国家相关部门将微生物检测列为食品检测的强制指标。菌落总数作为食品日常检测中最为普遍的卫生检验指标之一，能够反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，准确地展现细菌对食品的污染程度。在食品原料生产、成品加工、包装与运输的过程中，菌落总数的检测至关重要[1-5]。为了帮助检验人员全面了解和有效分析样品特征，准确理解检验水平，为实验室提供可靠的检测结果，体现日常实验工作的精确性和科学性，必须引入测量不确定度。测量不确定度是评估实验室检测水平的重要指标，衡量被测量值的不确定性大小，也是评价测量结果质量的关键参数。由于其能够反映测量结果的精确性、可靠性和准确性，测量不确定度在检验检测行业中得到广泛应用[6-7]。本研究以20份市售寿司样品为对象，根据《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012）[8]和《常用玻璃量器》（JJG 196—2006）[9]的规定，进行了食品中菌落总数的检测。文章中体现了《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》（GB 4789.2—2022）[10]执行标准。在此过程中，详细考察了测量不确定度的来源，然后对其进行详细评估，遵循标准的要求，最终得出了一组可信赖的测量不确定度置信区间。这一过程有助于确保食品样品中菌落总数的测定结果的准确性和可靠性。
1.1 一般资料
选取2023年4—8月20份市售寿司进行分析。平板计数琼脂，广东环凯微生物科技有限公司；
氯化钠（分析纯），国药集团化学试剂有限公司。Scout系列电子天平，奥豪斯仪器（常州）有限公司；
GR85DR高压蒸汽灭菌锅，致微（厦门）仪器有限公司；
恒温培养箱，上海玉博科技有限公司；
XH-B型旋涡混合器，江苏康健医疗用品有限公司。
1.2 方法
依据《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》（GB 4789.2—2022）[10]，称取25 g样品置于盛有225 mL生理盐水的无菌均质杯内，充分混合均匀，制成1∶10的样品匀液；
用1 mL无菌吸管于1∶10样品匀液吸取1 mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL稀释液的无菌生理盐水试管中，振摇试管，制成1∶100的样品匀液；
按上述操作，制备10倍系列稀释样品匀液，选择2～3个适宜稀释度的样品匀液，吸取1 mL样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做2个平皿；
同时，分别吸取1 mL空白稀释液加入2个无菌平皿内作空白对照；
配制平板计数营养琼脂培养基，及时将15～20 mL冷却至46 ℃倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀；
平皿水平放置，待琼脂凝固之后，将平板翻转，置于（36±1）℃恒温培养箱内，培养（48±2）h；
肉眼观察并认真记录平皿中的菌落数，按照标准的计数规则进行计算，选取菌落总数在30～300的平皿，将该稀释梯度的平皿的菌落总数数值乘以对应的稀释倍数，即可得到该待测样品的菌落总数。
式中N为样品菌落总数的和；
C为平板菌落总数之和；
n1为低稀释倍数（第一稀释度）平板个数；
n2为高稀释倍数（第二稀释度）平板个数；
d为稀释因子（第一稀释度）。
1.3 观察指标
观察各稀释倍数平板的菌落个数。
1.4 统计学处理
运用WPS 2019软件建立数据库，进行统计学分析。
2.1 测量不确定度的来源
在日常测试中，许多不确定因素会影响细胞总数。原因可以从人员、环境、仪器设备、材料、测量方法等多个角度进行分析。该实验的不确定性来源之一是人为因素。尽管由同一实验人员操作，但在相同稀释度下采集2个重复样品也会引入不确定性，该不确定性被定义为A类标准不确定性。另一个重要因素是仪器的设备：用量筒测量、用天平和刻度移液管测量是此类不确定度的主要因素。本试验使用相同的天平、量筒和刻度移液管，因此固定了类型影响值并定义了B型标准不确定度。本测试是由同一个人在同一环境、采用相同的测试方法进行的，因此可以忽略环境、测量方法和材料的影响。
2.2 A类标准不确定度的评定
对于20个样品进行菌落总数测定，每个稀释度的菌落数需做2个平板。由于微生物实验数据相差很大，不能直接进行统计，可以对检测结果取对数后，计算出样本结果对数值的平均值和残差平方和，其计算结果见表1。
表1 20份寿司中菌落总数计数结果及计算
根据贝塞尔公式，可以计算得出实验结果对数值标准偏差的合并样本标准差Sp：
在正常检测当中，因样品要进行2次平行实验，故由测量重复性引入的A类标准不确定度UA＝0.044 5。
2.3 B类标准不确定度的评定
2.3.1 由电子天平引入的不确定度
(3)规划水平年(2020年、2030年)灌溉保证率50%相比75%，水资源承载能力评分较高，说明可以采用降低保证率灌溉更多耕地的方法以达到总产值的增加，提高山塘水资源的承载能力。
称量样品，25.0 g至含有225 mL无菌生理盐水中，该过程使用的电子天平量程为0.2～620 g，根据天平的检定证书，电子天平的允许误差为±0.1 g，按均匀分布计算，k＝，故由电子天平引入的标准不确定度为：
则相对标准不确定度为：Ucrel（m）＝0.002 3。
2.3.2 由量筒引入的不确定度
在样液制备过程中，需要用250 mL量出式量筒量取225 mL生理盐水，根据《常用玻璃量器》（JJG 196—2006）规定，250 mL量出式量筒的允许误差为±2.0 mL，按均匀分布计算，k＝，故由量筒引入的标准不确定度为：
则相对标准不确定度为：Ucrel（v1）＝0.005 1。
2.3.3 由分度吸量管引入的不确定度
在制备10倍系列稀释样品匀液的过程中，使用了A级1 mL分度吸量管吸取样品匀液、A级10 mL分度吸量管吸取9 mL生理盐水，按照《常用玻璃量器》（JJG 196—2006）的规定，A级的1 mL分度吸量管和A级的10 mL分度吸量管，允许的误差分别为±0.01 mL和±0.025 mL，按均匀分布计算，k＝，故由A级1 mL分度吸量管引入的标准不确定度为：
相对标准不确定度为：Ucrel（v2）＝0.005 7
故由A级10 mL分度吸量管引入的标准不确定度为：
则相对标准不确定度为：Ucrel（v3）＝0.001 6。
故B类相对标准不确定度UB＝0.014 7。
2.4 合成标准不确定度
合成标准不确定度UC是指由在一个测量模型中各输入量的标准不确定度获得的输出量的标准测量不确定度。
故合成标准不确定度为：UC＝0.046 9。
2.5 扩展不确定度
扩展不确定度是预期结果的区间，具有一定的置信度（置信区间）。取95%的置信水平，v＝20，查t分布表得k＝2.086。
故扩展不确定度为：U＝0.098 7。
2.6 计算结果
根据相关规定，检测的结果在对数值log报告中表示为：log±0.097 8。举例来说，对于第2号样品，将2次检测结果取对数后求平均值，得到平均值为3.360 1，这个结果的取值范围在3.262 3～3.457 9。将这个对数结果取反对数后，得到测量结果的取值范围为1 800～2 800。其他样品的菌落总数计算结果也可以按照类似方式进行推导。
本试验是对市场上销售的20种不同种类的寿司进行检测，样本中菌落总数测定结果彼此差异较大，已经不适宜使用标准差来直接评价检测结果的不确定度，故应在取对数后计算结果，用这种方法来表示结果的不确定度。张云龙等[11]在评定烧烤制品菌落总数检验的不确定度时也用这种方法评定。
测量不确定度评定的结果表明，在测量过程中，由于测量重复性引入的A类标准不确定度对于实验结果的测量不确定度的影响较大，相比之下，来自天平称量、量筒、分度吸量管等引入的B类标准不确定度对不确定度的影响较小。识别测量不确定度的来源至关重要，因为测量不确定度的产生涉及多个因素，正确分析和辨认这些来源在确定测量不确定度方面具有重要作用，也为对测量不确定度评估奠定了基础。测量不确定度评定是确保食品菌落总数测试结果准确性的重要方法。食品样品本身的差异性、实验操作技术的不确定性以及统计分析等因素都会对菌落总数检验结果产生一定的影响，评定不确定度能够揭示测量结果的波动程度，并提供一个范围来描述测量结果的可信度[12]。食品样品的采集和处理过程对菌落总数的不确定度评定具有重要影响。在采集样品时，应确保样品的代表性和一致性，避免外界污染和样品自身变质。处理过程需要按照标准方法进行，严格控制操作流程和参数，确保实验的可重复性和准确性。实验室仪器的精密度也是评定菌落总数不确定度的关键因素之一。仪器需要定期进行校准和验证，以确保结果的准确性和可靠性。同时，仪器的使用者都需要经过专业培训，熟悉操作流程和仪器特点，提高实验的可重复性[13]。统计学方法在评定菌落总数不确定度中起着重要作用，通过对样本数量、变异性和可信度等进行统计分析，可以得出菌落总数测试结果的不确定度范围。不确定度的大小与样本数量、测量误差和置信水平等因素密切相关[14-16]。
综上所述，实验室在进行微生物培养时需要创建一个稳定的环境，这种稳定的环境能够有效地保障检验结果的准确性。食品菌落总数的不确定度评定是确保食品安全质量的重要手段。通过评定不确定度，可以提高食品菌落总数测试结果的可靠性和准确性，为食品安全管理提供科学依据，保障公众健康和食品安全。
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