柯丽娟 ，李小阳 ，刘骏 ，雷蕾 ，王忠
1.中国中医科学院中医药信息研究所，北京 100700；
2.中国中医科学院中医临床基础医学研究所，北京 100700
清热药主要功效为清解里热，常用于治疗里热证。热证有卫分、气分、营分、血分、实热、虚热等不同证型，临床应用清热药既取其共性特征，又根据证型配伍用药。本研究探究清热泻火药、清热燥湿药、清热解毒药、清热凉血药和清虚热药作用机制[1]，为清热功效的现代生物学机制研究提供新的思路。
1.1 活性成分筛选及对应靶点获取
5组清热类中药见表1。以药物名称为检索词，在TCMSP（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）、TCMID（http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/Login/login.html）、 NPASS （https://ngdc.cncb.ac.cn/databasecommons/database/id/4452）数据库中检索其活性成分。利用微生信在线平台（https://www.bioinformatics.com.cn）绘制韦恩图，得到5组药物各自特有活性成分集合及共有成分集合。
表1 清热类中药类别及药物名称
检索DrugBank（https://go.drugbank.com/legal/terms_of_use）、 NPASS （https://ngdc.cncb.ac.cn/databasecommons/database/id/4452）数据库，获取成分对应靶点，导入UniProt数据库进行规范化处理。
1.2 核心靶点筛选
将5类清热药活性成分对应靶点及共有成分对应靶点分别输入STRING数据库（https://cn.string-db.org），选择“multiple protein”，物种为“Homo sapiens”，设置confidence＞0.7，得到蛋白相互作用（PPI）网络；
将数据导入Cytoscape3.9.1软件，利用CytoHubba插件获得各组及共有成分的核心靶点。
1.3 GO功能、KEGG通路及疾病富集分析
利用DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov）对靶点进行GO功能、KEGG通路及疾病富集分析。GO功能富集结果通过基迪奥生物信息云平台tu2（https://www.omicshare.com）进行可视化展示，KEGG通路通过微生信在线平台进行可视化处理。再将5类清热中药及共有成分核心靶点分别导入 Metascape 数据库（https://metascape.org）进行DisGeNET富集分析。
1.4 分子对接验证
对清热药共有成分及核心靶点进行分子对接。从RCSB PDB数据库（https://www.rcsb.org）获得靶点的蛋白晶体结构，使用Discovery Studio 4.5.0软件“small molecules-prepare ligand”模块获得配体分子三维结构，使用small molecules minimize ligands 及CHARMm 力场进行能量最小化，保存为配体分子集；
蛋白分子去除晶体水分子后，使用“clean protein”模块加氢、补充不完整氨基酸残基，导入“CDOCKER”模块进行分子对接；
以原配体对接的CDOCKER_INTERACTION_ENERGY为参考值，判断其相互作用情况。
2.1 活性成分与对应靶点
共获得清热类中药活性成分2 715个，清热泻火药、清热燥湿药、清热解毒药、清热凉血药、清虚热药活性成分分别为297、609、1 196、224、389个，特有活性成分分别为174、412、849、145、205个。
5组药物共有活性成分7个，分别为亚油酸（Linoleic Acid）、棕榈酸（Palmitic Acid）、槲皮素（Quercetin）、糠醛（Furfural）、2-戊基呋喃（2-Pentylfuran）、香草酸（Vanillic Acid）、壬醛（Nonanal）。清热药物活性成分韦恩图见图1。清热泻火药、清热燥湿药、清热解毒药、清热凉血药、清虚热药及共有活性成分分别获得靶点117、241、402、87、260、196个。
图1 清热类中药活性成分韦恩图
2.2 蛋白相互作用网络构建与核心靶点
采用Cytoscape3.9.1构建清热类中药PPI网络，见本文OSID码。利用CytoHubba插件，以P值筛选核心靶点，5组药物及共有成分分别得到10个核心靶点，见表2。
表2 5组清热类中药及共有成分核心靶点（前10位）
2.3 GO功能富集分析
使用在线平台DAVID对5类清热药特有活性成分及共有成分对应靶点进行GO富集分析，包括生物过程（BP）、分子功能（MF）及细胞组分（CC）。每类药物P值排序前10位BP条目见图2。其中，清热泻火药参与的BP有外源代谢过程、对脂多糖的反应、葡萄糖醛酸基转移酶活性负调控、细胞葡萄糖醛酸化负调控、类黄酮葡萄糖醛酸化等；
MF包括酶结合、转录辅激活因子结合、锌离子结合、肽-赖氨酸-N-乙酰转移酶活性、葡糖醛酸基转移酶等；
CC为核质、核、细胞质、膜筏、细胞外泌体等。清热燥湿药参与的BP有外源代谢过程、类固醇代谢过程、对外源性刺激的反应、单碳代谢过程、雌激素代谢过程等；
MF包括酶结合、碳酸盐脱水酶活性、水解酶活性、锌离子结合、芳香化酶活性等；
CC为质膜的组成部分、质膜、突触前膜的组成部分、突触后膜、乙酰胆碱门控通道复合体等。清热解毒药参与的BP有外源代谢过程、细胞葡萄糖醛酸化、线粒体电子运输、细胞色素c到氧、腺苷酸环化酶激活肾上腺素受体信号通路、对外源性刺激的反应等；
MF为酶结合、RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性，配体激活的序列特异性DNA结合、细胞色素c氧化酶活性、相同蛋白结合、延迟整流钾通道活性等；
CC为线粒体呼吸链复合体Ⅳ、线粒体、质膜、电压门控钾通道复合物、质膜的组成部分等。清热凉血药参与的BP有对β淀粉样蛋白的反应、单碳代谢过程、胶原分解代谢过程、细胞外基质分解、细胞对UV-A 的反应等；
MF为锌离子结合、碳酸盐脱水酶活性、水解酶活性、酶结合、内肽酶活性等；
CC为核质、胞质溶胶、细胞质、核、细胞外区等。清虚热药参与的BP有兴奋性突触后电位、神经系统过程、化学性突触传递、离子跨膜转运、膜电位的调节等；
MF为神经递质受体活性、递质门控离子通道活性参与突触后膜电位的调节、细胞外配体门控离子通道活性、铁离子结合、L-抗坏血酸结合等；
CC为突触后膜、突触、质膜的组成部分、神经元投射、GABA-A受体复合物等。共有成分对应靶点参与的BP有外源代谢过程、蛋白质磷酸化、蛋白质自磷酸化、肽基丝氨酸磷酸化、雌激素代谢过程等；
MF为蛋白丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、酶结合、蛋白激酶活性、ATP结合、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性等；
CC为核质、细胞质、胞质溶胶、核、大分子复合物等。
图2 5类清热类中药GO功能富集分析
2.4 KEGG通路富集分析
P值排序前10位的KEGG通路富集分析结果见图3。其中，清热泻火药特有活性成分对应靶点富集通路77条，主要涉及化学致癌作用-受体激活、化学致癌作用-DNA加合物、类固醇激素生物合成、视黄醇代谢、药物代谢-细胞色素P450等；
清热燥湿药特有活性成分对应靶点富集通路101条，主要涉及类固醇激素生物合成、化学致癌作用-受体激活、药物代谢-细胞色素P450、氮代谢、细胞色素P450等；
清热解毒药特有活性成分对应靶点富集通路186条，主要涉及代谢途径、化学致癌作用-受体激活、胆汁分泌、药物代谢-细胞色素P450、血清素能突触等；
清热凉血药特有活性成分对应靶点富集通路37条，主要涉及氮代谢、膀胱癌症、脂质与动脉粥样硬化、内分泌抵抗、甲状腺激素信号通路等；
清虚热药特有活性成分对应靶点富集通路96条，主要涉及尼古丁成瘾、神经活性配体-受体相互作用、血清素能突触、逆行内源性大麻素信号传导、GABA能突触等；
共有成分对应靶点富集通路143条，主要涉及内分泌抵抗、化学致癌作用-DNA加合物、氮代谢、细胞色素P450对外源性物质的代谢、化学致癌作用-受体激活等。
图3 5类清热类中药对应靶点KEGG通路富集分析
2.5 疾病富集分析
5类清热类中药活性成分及共有成分对应靶点疾病富集分析结果见表3。“疾病-靶点” Circos图见图4。由图4可知，清热泻火药和清热燥湿药、清热燥湿药和清热解毒药相同核心靶点较多，可能说明商户类别药物富集的疾病相似度较高。
图4 5类清热类中药对应靶点Circos图
表3 5类清热类中药及共有成分对应靶点疾病富集分析
2.6 分子对接结果
7个共有活性成分与其核心靶点进行分子对接，结果见表4。其中，SRC和棕榈酸、槲皮素、亚油酸的对接结果，MAPK和棕榈酸、槲皮素的对接结果及ESR2和棕榈酸、槲皮素、亚油酸的对接结果均优于原配体。SRC-棕榈酸、MAPK-槲皮素、ESR2-亚油酸的作用模式见图5。
图5 SRC-棕榈酸、MAPK-槲皮素、ESR2-亚油酸作用模式
表4 A6组清热类药物有效成分与核心靶点分子对接结果（kcal/mol）
由图2可知，5类清热药活性成分相应靶点GO富集结果BP条目都包含外源代谢过程和单碳代谢过程，说明中药可能通过以上2个过程发挥功效；
其中，清热泻火药、清热燥湿药、清热解毒药特有靶点BP相似度较高，达60%，主要富集在外源代谢过程、单碳代谢过程、葡萄糖醛酸基转移酶活性的负调控、细胞葡萄糖醛酸化的负调控、雌激素代谢过程、细胞葡萄糖醛酸化。清热凉血药、清虚热药特有靶点BP与其他3类中药BP相似度不高，具有特异性。
由图3可知，代谢途径是5类清热药共有信号通路，该信号通路可能在清热功效中发挥重要作用。清热泻火药、清热燥湿药、清热解毒药主要富集在新陈代谢类信号通路，相似度达60%，包括代谢途径、化学致癌作用-受体激活、类固醇激素生物合成、视黄醇代谢、药物代谢-细胞色素P450、胆汁分泌等通路。清热凉血药和清虚热药与其他3类相似度较低，具有特异性。清热凉血药和清虚热药主要富集在生物体系统类信号通路，其中，清热凉血药富集在内分泌系统类的信号通路较多，清虚热药富集在神经系统类的信号通路较多。
结合GO功能、KEGG和疾病富集分析结果发现，清热泻火药可治疗的优势疾病为乳腺癌、肿瘤，其功效可能与生物过程对脂多糖的反应、脂肪酸代谢过程的负调节、外源性葡萄糖醛酸化和信号通路癌症途径有关；
清热燥湿药可治疗的优势疾病为抑郁症、乳腺癌、肥胖，可能与类固醇代谢过程、对尼古丁的反应有关；
清热解毒药可治疗的优势疾病为抑郁症、乳腺癌、肥胖，可能与生物学过程线粒体电子运输、腺苷酸环化酶激活肾上腺素受体信号通路、蛋白质均低聚、药物代谢-其他酶、化学致癌作用-活性氧等有关；
清热凉血药可治疗的优势疾病为乳腺癌、炎症反应、肺气肿，可能与生物过程对β淀粉样蛋白的反应、胶原分解代谢过程、细胞外基质分解、膀胱癌症、甲状腺激素信号通路、松弛素信号通路等有关；
清虚热药可治疗的优势疾病为慢性酒精中毒、抑郁症，可能与生物过程兴奋性突触后电位、神经系统过程、化学性突触传递、尼古丁成瘾、神经活性配体-受体相互作用、逆行内源性大麻素信号传导等有关。5种药物发挥清热功效可能与生物学过程中外源代谢过程、单碳代谢过程以及信号通路中代谢途径有关，可治疗的疾病为肿瘤、乳腺癌。
清热药抗乳腺癌的核心活性成分可能是棕榈酸、槲皮素、香草酸、亚油酸。付红萍等[2]研究发现，棕榈酸水平可反映乳腺癌发展过程潜在代谢变化，可能成为潜在的乳腺癌标志物；
Abramczyk等[3]研究表明，棕榈酸可作为乳腺癌的关键分子靶点。清热药知母、紫草、蒲公英、鱼腥草、牛黄、穿心莲、青蒿、金银花、栀子、地骨皮、连翘、大青叶、板蓝根、黄柏、黄芩均含有棕榈酸。研究表明，槲皮素可下调葡萄糖转运蛋白1表达，减少乳腺癌细胞对葡萄糖的摄取，增加乳腺癌细胞内三磷酸腺苷水平，对乳腺癌细胞能量代谢具有调控作用，可作为潜在的抗癌剂或抗癌辅助剂[4]；
同时，槲皮素可激活PTEN蛋白表达，抑制PI3K/AKT和JNK信号通路，诱导人乳腺癌细胞MCF-7凋亡[5]。清热药苦参、金银花、蒲公英、青蒿、黄连、栀子、黄柏、山豆根、牡丹皮、连翘、鱼腥草均含有槲皮素。三叶青三氯甲烷部位的体外抗肿瘤活性由多种成分共同作用产生，包含连翘、栀子、地骨皮、黄连、牡丹皮、山豆根、金银花中的香草酸[6]。此外，清热药紫草、蒲公英、金银花、鱼腥草、栀子、地骨皮、板蓝根、连翘、黄芩中均含有亚油酸，亚油酸可通过调节microRNA表达水平抑制乳腺癌的发生[7]。
既往研究中，清热药相关网络药理学研究多关注单味中药或处方，如陈光辉等[8]发现栀子苷具有抗抑郁作用、杨思慧等[9]发现黄芩汤可减轻子宫内膜癌化疗不良反应等。但相同功效药物之间分子机制对比研究较少，本文为中药功效分子机制研究提供新的思路。
综上所述，本文运用网络药理学与分子对接方法探讨5类清热类中药各自功效与共同功效的作用机制，筛选药物中可能具有抗乳腺癌活性的活性成分，为新药研发提供思路，但本研究结论仍需实验进一步验证。
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