杜昭换,姜忠丽,赵秀红
(沈阳师范大学粮食学院,辽宁 沈阳 110034)
酚类物质是广泛存在于植物组织中的一类植物化学物质。目前已报道酚类具有抗氧化、抑菌、降血脂、降血糖、降低农药对机体毒性、吸收紫外线和结合金属离子等功效[1]。生物体内自由基过多堆积造成的氧化损害,是导致生物衰老和诱发Ⅱ型糖尿病等相关代谢性疾病的重要原因[2]。研究表明,具有抗氧化活性的物质,能有效清除体内多余的自由基,减少活性物质对细胞的氧化损害,预防多种疾病的发生[3]。糖尿病是一种慢性代谢紊乱疾病,其特点是血糖过高,常因胰岛素分泌不足或胰岛素作用障碍而引起,而抑制消化酶的活性可减缓餐后血糖水平的提高,是治疗糖尿病的有效手段之一。临床上常通过检测消化酶的活性抑制作用,用于初步判断药物是否具有降糖活性,并将降糖药物和具有降糖作用的食物作为预防、改善糖尿病的重要措施之一[4]。
糙米是稻谷经加工脱壳后的产品。与精米相比,糙米中的酚酸等生物活性物质含量更高。这些生物活性物质具有抗氧化[5]、抑菌[6]、消炎[7]及抗病毒[8]等功效。糙米多酚降血糖的临床研究虽已有报道,但其与品种差异是否有关尚未见报道。
对比辽宁地区4个品种糙米的多酚、黄酮含量以及抑制DPPH·、超氧阴离子自由基、ABTS+·能力和葡萄糖苷酶、淀粉酶抑制活性的差异,在此基础上进一步分析糙米多酚含量与其抗氧化能力和体外降糖能力的关系,探讨糙米多酚抗氧化与降糖作用的关系,以期为阐明糙米多酚降血糖的机理提供一定研究思路,并为今后糙米的开发利用提供参考。
1.1 试验材料
材料:挑选4个品种糙米,粉碎过40目筛,糙米粉备用。4个品种分别是小粒香、Type-619、软米和龙粳,辽宁盛宝米业提供。
主要试剂:石油醚,天津市富宇精细化工公司;纤维素酶、福林酚试剂、PNPG,上海瑞永生物科技;柠檬酸、柠檬酸钠,沈阳东兴试剂厂;没食子酸,南京源值生物有限公司;DPPH(1,2-二苦基-2-三硝基苯亚肼)、ABTS(2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐)、抗坏血酸,上海蓝季生物发展有限公司;过硫酸钾、葡萄糖苷酶、淀粉酶,天津市大茂化学试剂厂;HCl、阿卡波糖、DNS(3,5-二硝基水杨酸),国药集团;Tris,北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司;邻苯三酚,合肥巴斯夫生物科技有限公司;无水乙醇,恒兴试剂;淀粉,上海麦克林生化科技有限公司;磷酸二氢钾、磷酸氢二钾,沈阳市新西试剂厂。
1.2 仪器设备
ESJ120-4B电子分析天平,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;UV-1200S分光仪,翱艺仪器(上海)有限公司;200T粉碎机,永康市铂欧五金制品有限公司;HG-9146A鼓风干燥箱,上海精宏实验设备有限公司;15A481超声清洗器,宁波新芝生物有限公司;冷冻离心机,阿凡提·贝克曼库尔特股份有限公司;ZQPW-70恒温振荡保温箱,天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司;HH-6恒温水浴锅,上海皓庄仪器有限公司;Scientz-12N冷冻烘干机,宁波新芝生物科技有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1糙米中多酚含量的测定
根据姜忠丽等[9]的方法提取糙米多酚。具体方法如下:准确称量脱脂糙米粉末1.0 g,并将缓冲液(柠檬酸-柠檬酸钠溶液pH5.4)预热。在样品中依次加入1.0 g×0.5%纤维素酶和30 mL缓冲溶液,超声(350 W、55℃、10 min)后以3 500 r/min的条件将提取液冷却离心15 min取上清液,保存于-18℃冰箱。
多酚含量的测定采用福林-酚[10]法。配制0～5.0 μg/mL没食子酸溶液,0.5 mL糙米样品多酚萃取液或没食子酸溶液,1.0 mL福林酚,Na2CO3(15%、2.0 mL)溶液,避光反应2 h,于760 nm处测吸光度。其中X=0.016P-0.002 6,R2=0.999 8,X为吸光度,P为质量浓度(μg/mL)。
糙米中多酚含量的计算公式:
式中:W为糙米多酚含量,mg/g;C为样品中酚类质量浓度,μg/mL;V1为稀释的体积,mL;V2为待测液体积,mL;M为糙米粉的质量,g;V3为取样体积,mL。
1.3.2糙米中黄酮含量的测定
标准溶液配制:精确称量芦丁标准品10 mg,加少量30%乙醇溶解,超声2 min溶化试样,用乙醇定容于50 mL容量瓶中,即得芦丁标准液0.2 mg/mL。
标准曲线制作:芦丁标准液分别取0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL装在25 mL容量瓶中,各加5%亚硝酸钠0.7 mL摇匀,静置5 min,加入10%硝酸铝0.7 mL摇匀,放置6 min后加入1%氢氧化钠5 mL,最后用30%乙醇定容至25 mL。静置10 min,在510 nm下用试剂空白作参比,进行吸光度测定,并绘制标准曲线。得到回归方程A=10.23C-0.017,R2=0.998。
根据姜忠丽等[11]的研究方法测定糙米中的黄酮含量。
1.3.3抗氧化试验
1.3.3.1清除DPPH自由基能力测定[12]
配制0.2 mmol/L DPPH溶液并将吸光度值调至0.60±0.02,分别取2 mL糙米多酚提取液和2 mL DPPH溶液避光反应30 min,于517 nm处测吸光度。阳性对照为抗坏血酸。
式中:R1为DPPH自由基清除率;A1为待测溶液吸光度;A2为乙醇替代DPPH吸光度;A0为水替代样液吸光度。
1.3.3.2超氧阴离子自由基清除率测定[13]
取糙米各提取物0.1 mL,添加0.1 mol/L pH 8.2的三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲溶液2.8 mL,混匀。25℃水浴10 min,加入3 mmol/L没食子酚(焦性没食子酸)溶液0.1 mL,每30 s于325 nm波长处测定一次吸光度值,连续测定5 min,记录数据,绘制其回归方程,空白对照为蒸馏水,阳性对照为抗坏血酸。计算公式如下:
式中:R2为超氧阴离子自由基清除率;Va为蒸馏水斜率;Vb为样品斜率。
1.3.3.3ABTS阳离子自由基清除率测定[14]
取7.4 mmol/L的ABTS原液与等量2.45 mmol/L的过硫酸钾混合,在黑暗中放置12～16 h,用无水乙醇稀释ABTS溶液至734 nm波长吸光度0.70±0.02,得到ABTS工作液。在4.0 mL ABTS工作液中加入1.0 mL糙米粗提液混合均匀,常温下在暗处反应6 min后,立即测定734 nm处吸光度。对照组选用抗坏血酸。糙米多酚粗提液对ABTS自由基清除率计算公式如下:
式中:R3为ABTS阳离子自由基清除率;A1为样品吸光度;A2为水代替ABTS的吸光度;A0为水代替样液的吸光度。
1.3.4体外降糖试验
1.3.4.1葡萄糖苷酶活性抑制试验[15]
取0.5 mL待测溶液或阿卡波糖与0.5 mL葡萄糖苷酶溶液(1.5 U/mL)混合,37℃下反应10 min。将混合液加入0.5 mL、1 mmol/L PNPG反应15 min后与2 mL、1 mol/L碳酸钠溶液混合,并用PBS定容至5 mL,在沸水浴中反应5 min后立即冷却。于405 nm处检测吸光度。阿卡波糖作为对照物。葡萄糖苷酶活性抑制率公式如下:
式中:X1为葡萄糖苷酶活性抑制率;A1为待测溶液吸光度;A2为PBS替代葡萄糖苷酶吸光度;A0为PBS替代样液吸光度。
1.3.4.2淀粉酶活性抑制试验[16]
将0.5 mL待测溶液或阿卡波糖与0.5 mL的淀粉酶溶液(2 U/mL)混合,在37 ℃条件下反应10 min。将混合液加入0.5 mL、1%的淀粉溶液反应10 min并与0.5 mL二硝基水杨酸(DNS)混合,用PBS定容混合物搅拌至相应体积,沸腾反应5 min后立即冷却。于540 nm处对吸光度进行检测。其中对照物为阿卡波糖,实验每组重复3次。淀粉酶活性抑制率公式如下:
式中:X2为淀粉酶活性抑制率;A1为待测溶液吸光度;A2为PBS替代淀粉酶吸光度;A0为PBS替代样液吸光度。
2.1 不同品种糙米多酚和黄酮含量
不同品种糙米多酚含量比较见图1。由图1可知,糙米中的多酚类物质含量因其品种的不同而有所差异,其中软米和小粒香亦达到显著水平(P<0.05)。4个品种糙米多酚含量从高到低依次为软米>小粒香>Type-619>龙粳。该结果可能与其品种和生长情况有关。
图1 不同品种糙米多酚含量对比
不同品种糙米黄酮含量对比见图2。由图2可知,4个品种糙米黄酮含量从高到低依次仍然为软米>小粒香>Type-619>龙粳。结合图1和图2可知,软米的多酚含量为8.33 mg/g,龙粳的多酚含量为4.81 mg/g,两者相差较大;而软米的黄酮含量为3.35 mg/g,龙粳的黄酮含量为2.89 mg/g,两者相差较小。
图2 不同品种糙米黄酮含量对比
2.2 糙米多酚清除DPPH自由基能力对比
以抗坏血酸标准品作为对照,不同品种糙米多酚对DPPH自由基的清除能力对比见图3。
图3 不同品种糙米DPPH自由基清除率对比
DPPH自由基清除是指氢气或给电子的抗氧化剂还原DPPH-乙醇溶液,生成黄色的非自由基DPPH-H的过程[17]。DPPH-乙醇溶液在517 nm有特征峰。由图3所示,不同品种糙米多酚均具有一定的清除自由基的作用,但具有很大的差异,其中软米和龙粳品种之间达到了显著水平(P<0.05)。清除DPPH•的能力表现从高到低依次为软米>小粒香>Type-619>龙粳,软米清除DPPH•的能力为48.95%,龙粳清除DPPH•的能力为35.55%,但均低于抗坏血酸清除DPPH•的能力。这表明糙米多酚具有清除DPPH•的能力,并且这与多酚含量的多少可能有一定的关系。
2.3 不同品种糙米多酚清除超氧阴离子自由基能力
以抗坏血酸标准品作为对照,不同品种糙米提取物对超氧阴离子自由基清除情况见图4。
图4 不同品种糙米超氧阴离子自由基清除率对比
由图4可知,不同品种糙米多酚均有一定的清除超氧阴离子自由基作用,但差异较大,其中软米和龙粳品种之间达到显著水平(P<0.05),Type-619和小粒香无显著差别。清除超氧阴离子自由基的能力表现从高到低依次为软米>小粒香>Type-619>龙粳,其中软米的超氧阴离子自由基清除率为72.95%,龙粳的超氧阴离子自由基清除率为55.93%。超氧阴离子自由基清能力相对DPPH自由基清除能力而言有所升高,但是尚没有达到抗坏血酸的百分比要求。
2.4 不同品种糙米多酚ABTS+·清除能力测定
以抗坏血酸标准品作为对照,不同品种糙米提取物对ABTS+·清除率的影响见图5。
图5 不同品种糙米ABTS+自由基清除能力测定
ABTS+·是一种氧化反应时会产生蓝绿色等液体的氧化物酶底物,在抗氧化剂的作用下,ABTS+·会被清除,从而呈现出颜色变浅、吸光度降低的特点,因此样品的抗氧化效果可以通过测定吸光度来得到很好的评价。由图5可知,不同品种糙米的ABTS+·清除能力表现与DPPH·清除能力相似,最强同样为软米。
2.5 不同品种糙米对葡萄糖苷酶活性抑制率的影响
不同品种糙米对葡萄糖苷酶活性抑制率的影响见图6。葡萄糖苷酶是碳水化合物消化和葡萄糖释放的关键催化酶,位于小肠刷状边缘的葡萄糖苷酶可以将寡糖末端非还原性(1→4)键水解为肠道上皮细胞易吸收的单糖[18]。因此,降低葡萄糖苷酶活性的抑制率能有效地减缓单糖的产生,降低餐后高血糖的发生率。
图6 不同品种糙米葡萄糖苷酶活性抑制率
不同品种的糙米对葡萄糖苷酶活性的抑制率范围在28.11%～33.63%,抑制率从高到低依次为软米>小粒香>Type-619>龙粳;其中软米对葡萄糖苷酶活性的抑制率为33.63%,阿卡波糖对葡萄糖苷酶活性的抑制率为62.34%,软米对葡萄糖苷酶活性的抑制率可达到阿卡波糖对葡萄糖苷酶活性抑制率的0.54倍。这表明糙米对葡萄糖苷酶活性的抑制作用相对较强,作为食品具有较为理想的抑制作用,具有深入研究及应用的潜力。
2.6 不同品种糙米对淀粉酶活性的抑制作用
不同品种糙米对淀粉酶活性的抑制作用见图7。淀粉酶是体内将碳水化合物水解成葡萄糖以便于在细胞内运输的关键酶,淀粉被该酶降解为二糖或较低聚合度的糖,并进一步催化为单糖(葡萄糖),葡萄糖最终被吸收进生物血液循环系统中。因此,它已被作为控制餐后高血糖的一种治疗方法。
图7 不同品种糙米淀粉酶活性抑制率
4个糙米品种对淀粉酶活性的抑制率范围在28.02%～33.16%,抑制率大小依次为软米>小粒香>Type-619>龙粳;其中软米对淀粉酶抑制率为33.16%,阿卡波糖对淀粉酶抑制率为55.48%,软米对淀粉酶活性抑制率可达到阿卡波糖对淀粉酶活性抑制率的0.60倍。这表明糙米对淀粉酶活性的抑制作用相对较强,可通过大孔树脂进一步纯化提高其对淀粉酶活性的抑制率,达到更强的抑制效果。
2.7 糙米抗氧化和降血糖与多酚含量的相关性分析
为了探明糙米中多酚含量与其抗氧化能力和体外降血糖能力之间的关系,对测量指标这6者之间进行了相关性分析。
糙米多酚含量与抗氧化能力和体外降血糖能力的相关性分析见表1。由表1可知,糙米多酚含量与ABTS+自由基清除能力呈极显著正相关(P<0.01),与DPPH自由基和超氧阴离子自由基清除率呈显著正相关(P<0.05)。此外,糙米多酚含量与葡萄糖苷酶、淀粉酶活性抑制率呈显著正相关(P<0.05)。徐金瑞等[19]发现,番石榴多酚对葡萄糖苷酶活性抑制率随多酚含量增加而增大,且剂量-效应呈正相关关系,与本试验结果一致;杨丽珍[20]发现,荔枝壳的游离酚和结合酚对淀粉酶活性的抑制率随着多酚浓度的增加而增加,这与本实验的结果一致。以上研究结果表明,糙米多酚可能是其抗氧化与降血糖作用的主要物质基础。
表1 糙米的抗氧化能力、体外降血糖能力和总酚含量的相关系数
2.8 基于主成分分析筛选评价抗氧化能力和体外降血糖的指标
本研究的主成分分析是利用降维的思想,将6个指标转换成若干个综合指标的多元统计方法,以确保在最大程度上保留6个指标的信息,其中每个综合指标(主要成分)都是原始变量的线性组合,互不相干,这就使得主成分比原始的6个指标更能评价糙米的抗氧化性和降血糖指标。
2.8.1数据标准化处理
由于多酚含量与这几个指标考核不是统一的指标,因此需对6个原始数据进行标准化处理。4个糙米品种的多酚含量与所有原始指标的标准化处理见表2。
表2 不同品种糙米各项指标标准化结果
2.8.2主成分提取和贡献率
从表3可以看出,成分1的特征值为5.776,远远超过1;并且成分1的累计贡献率为96.267%,说明了原有变量总方差的96.627%可以表示大多数原有指标的信息,并在此基础上,利用该主成分取代原有的6个指标变量。这个主成分主要以葡萄糖苷酶活性抑制率、DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率和淀粉酶活性抑制率为主,多酚含量和超氧阴离子自由基清除率为辅。
表3 主成分的特征值及贡献率
2.8.3特征向量计算
表4是不同品种糙米各指标能力的载荷矩阵,它反映了各变量对主成分的影响程度,而绝对值越大,则对主成分的影响就越大。根据表3中的特征值和表4中各主成分载荷系数除以主成分相对应的特征值开平方根,可以得到表5中各性状指标的成分系数得分矩阵,进而可以算出其特征向量。
表4 不同品种糙米各指标能力载荷矩阵
表5 各指标的成分系数得分矩阵
由表5可以得到这个主成分的函数表达式F1:
F1=0.403X1+0.41X2+0.406X3+
0.408X4+0.413X5+0.408X6
将主成分函数以及各主成分对应的方差贡献率作为权重,得到综合评价函数:
F=0.39X1+0.396X2+0.392X3+
0.394X4+0.4X5+0.394X6
式中:X1为多酚含量;X2为DPPH自由基清除率;X3为超氧阴离子自由基清除率;X4为ABTS+自由基清除率;X5为葡萄糖苷酶活性抑制率;X6为淀粉酶活性抑制率。
2.8.4糙米各个指标综合评价
表6为4种糙米品种的主成分分析综合得分与排名,分数越高代表糙米品种的各个指标越强,其中F1表示主成分的得分,结合上述分析可知测定的糙米各个指标差异性显著,且多酚含量分别与DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率、葡萄糖苷酶活性抑制率和淀粉酶活性抑制率相关性显著。从主成分分析综合评分得到的各个指标最强的是软米,其次是小粒香;而最弱的是龙粳。
表6 4种糙米品种的主成分分析综合得分与排名
试验结果表明,4个品种糙米在体外抗氧化和降血糖方面表现良好,且在多酚含量、抗氧化能力、葡萄糖苷酶和淀粉酶活性抑制率等指标上均有明显差异,从主成分分析综合评分得到的抗氧化能力和体外降血糖指标最强的是软米,其次是小粒香;而最弱的是龙粳。
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