张肖静,张涵,董永恩,龚瑶瑶,宋亚丽,张杰
1.郑州轻工业大学 环境污染治理与生态修复河南省协同创新中心/材料与化学工程学院,河南 郑州 450001;
2.哈尔滨工业大学 环境学院,黑龙江 哈尔滨 150090
厌氧消化是指微生物在厌氧条件下,通过生物代谢将有机物转化为甲烷和CO2并合成自身细胞物质的生物学过程[1]。目前,厌氧消化广泛应用于多种废水的处理,尤其是含有较高质量浓度有机物的轻工行业废水,如造纸废水[2]、啤酒酿造废水[3]、纺织废水[4]、屠宰及肉类加工废水[5]等。据《2019—2021年中国生态环境统计年报》[6-8]显示,造纸、纸质品业、纺织业和农副食品加工业所排放的废水位列中国工业废水排放量的前四位,具有排放量大、化学需氧量(Chemical Oxygen Demand, COD)高、基质浓度波动较大等水质特点。
但是,多种轻工行业有机废水中同时含有氨氮且质量浓度波动较大,厌氧消化过程不但对氨氮几乎无去除能力,还可能释放氨氮。氨氮作为厌氧微生物重要的营养来源,不仅参与细胞内核酸、氨基酸和蛋白质的合成,同时有利于维持细胞生长所需的中性pH条件[9]。当氨氮质量浓度小于400 mg/L时,可增强厌氧消化过程中的产甲烷古菌活性[10],但过高质量浓度的氨氮会抑制甚至毒害厌氧消化微生物尤其是产甲烷古菌的活性[11]。另有研究[12-14]表明,当进水中氨氮质量浓度达到800 mg/L时,厌氧消化过程的产甲烷古菌活性受到抑制,但也有研究[9]认为,质量浓度高于1500 mg/L的氨氮会抑制厌氧消化过程。由此可知,关于氨氮质量浓度对厌氧消化工艺的影响规律及抑制阈值尚无明确的结论,且现有研究主要集中在中高温厌氧消化工艺,对于常低温条件下的厌氧消化工艺关注较少。然而,大多废水尤其是COD较高的轻工行业废水,水温均为常低温(<25 ℃),厌氧消化微生物在常低温条件下是否对氨氮质量浓度具有更加灵敏的响应尚未可知。
为进一步研究氨氮质量浓度对常低温条件下厌氧消化处理轻工行业废水性能的影响,本文拟在升流式厌氧污泥床(Up-flow Anaerobic Sludge Blanket,UASB)内启动厌氧消化工艺,在常低温条件下运行并逐步提高进水氨氮质量浓度,跟踪分析其COD去除性能、污泥特性和古菌群落演替,分析氨氮质量浓度对厌氧消化工艺的影响规律,以期明确采用厌氧消化工艺处理含高氨氮废水的可行性,同时为后续厌氧消化串联自养脱氮工艺处理轻工行业废水提供理论参考。
1.1 主要材料、试剂与仪器
主要材料:接种污泥为郑州轻工业大学实验室培养后长期闲置的厌氧消化颗粒悬浮固体,平均粒径2.5 mm,接种量500 mL,混合液悬浮固体(Mixed Liquor Suspended Solids,MLSS)质量浓度为13.8 g/L。闲置过程进水COD质量浓度维持在5000 mg/L,以维持污泥活性。
主要试剂:NH4Cl、CH3COONa·3H2O、NaHCO3,均为分析纯,天津市科密欧化学试剂有限公司。
主要仪器:TU-1810型紫外分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;Multi3430型便携式多功能水质检测仪,德国WTW公司;WWC-PCO2型COD氨氮五参数水质检测仪,中科谱创科技有限公司。
图1 实验装置图Fig.1 Diagram of the experimental device
1.2 实验设置
实验所用UASB的有效容积2.2 L,三相分离区有效容积2.3 L,同时设置回流管线,回流比为5～15,实验装置见图1。实验过程共分为2个阶段,分别为厌氧消化工艺的启动阶段和氨氮质量浓度对厌氧消化性能影响的实验阶段,分别记为U1和U2,各阶段具体运行参数见表1。在第0 d、149 d和203 d取污泥样品,分别命名为u0、u1和u2,用于测定胞外聚合物(Extracellular Polymeric Substance,EPS)、溶解性微生物产物(Soluble Microbial Products,SMP)和古菌群落组成。此外,为维持较为稳定的MLSS并加速厌氧消化工艺启动,分别在第4 d、11 d、34 d、56 d、69 d和90 d向反应器内添加200 mL厌氧消化颗粒污泥,第127 d添加100 mL厌氧消化颗粒污泥。在U2阶段,为了保证氨氮质量浓度为单一影响因子,整个阶段未添加厌氧消化颗粒污泥,也未进行排泥处理,水力停留时间(Hydraulic Retention Time,HRT)也维持不变。
实验采用人工模拟废水,废水中氨氮质量浓度为200～1400 mg/L,由NH4Cl提供;COD质量浓度为2000 mg/L,由CH3COONa·3H2O提供;碱度为0～1000 mg/L,由NaHCO3提供;此外,加入220 mg/L的KH2PO4、150 mg/L的MgSO4·7H2O、10 mg/L的CaCl2和1 mL/L的微量元素Ⅰ和Ⅱ[15]。
表1 实验各阶段的运行参数Table 1 Operational conditions in each phase of the experiment
1.3 分析方法
采用便携式多功能检测仪测定进出水pH值和温度。根据文献[16],采用纳氏试剂分光光度法测定氨氮质量浓度;采用N-1-萘基乙二胺分光光度法测定亚氮质量浓度;采用紫外分光光度法测定硝氮质量浓度;采用快速消解分光光度法测定COD质量浓度。参照文献[17]所述方法提取EPS和SMP,分别采用Folin-酚法和蒽酮-硫酸法测定EPS和SMP中蛋白质和多糖含量。采用重量法测定MLSS质量浓度。总氮去除率、COD去除率、进水氨氮负荷/(kg·(m3·d)-1)和COD去除负荷/(kg·(m3·d)-1)的计算公式如下:
其中,C[TN]表示总氮的质量浓度/(mg·L-1)。
其中,C[COD]表示COD的质量浓度/(mg·L-1)。
其中,C[氨氮]表示氨氮的质量浓度/(mg·L-1)。
1.4 高通量测序
污泥样品的高通量测序委托上海美吉生物医药有限公司完成。因产甲烷古菌为本实验中厌氧消化体系的主要功能微生物,故测定了污泥中的古菌组成及含量变化,以分析氨氮质量浓度对厌氧消化微生物组成的影响。首先根据E.Z.N.A.®soil DNA kit(Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.)说明书提取DNA,之后采用两轮巢式扩增法扩增合格的DNA。采用的古菌测序引物为340F/1000R(340F:CCCTAYGGGGYGCASCAG;1000R:GGCCATGCACYWCYTCTC)和349F/806R(349F:GYGCASCAGK-CGMGAAW;806R:GGACTACVSGGGTATCTAAT)[18]。
1.5 数据处理
采用 Microsoft Excel 2021、Origin 2021及SPSS Statistics软件对实验数据进行计算、方差分析、均值的多重比较和相关性分析;利用美吉科服网(https:∥www.majorbio.com)计算分析古菌多样性和种群丰度变化。
2.1 厌氧消化工艺的启动
厌氧消化工艺的启动过程分为3个阶段,各阶段的污染物去除情况见图2。由图2可知,U1.a阶段(1～76 d)的进水COD质量浓度平均值为2091 mg/L,出水COD质量浓度从最初的2722 mg/L逐渐降低。前3 d出水COD质量浓度高于进水,这是由于本实验所用的接种污泥长期保存于COD质量浓度为5000 mg/L的环境中,当接种于UASB后,其吸附的COD逐渐被释放。第4 d和11 d添加厌氧消化颗粒污泥后出水COD质量浓度快速下降,第19～33 d降低至681 mg/L,COD去除率和COD去除负荷稳定在69%和1.776 kg/(m3·d),表明间歇添加厌氧消化颗粒污泥维持较为稳定的MLSS有利于厌氧消化工艺的启动。第34 d继续添加200 mL厌氧消化颗粒污泥,将回流比从7.0调大至10.0,然而,第34～46 d出水COD质量浓度升高,最高达到1345 mg/L,COD去除率和COD去除负荷分别降低至51%和1.319 kg/(m3·d)。由于在运行过程中发现UASB的内壁生长了大量红褐色霉菌,分析第34～46 d COD去除率下降的原因可能是打开反应器清理霉菌时带入了空气,从而抑制了厌氧消化功能菌的活性。为进一步提高COD去除率,第49 d时,将回流比升至15.0,第56 d和69 d时分别添加200 mL厌氧消化颗粒污泥,第70～76 d COD去除率和COD去除负荷分别提高至71%和1.818 kg/(m3·d),说明间歇添加厌氧消化颗粒污泥有利于厌氧消化的启动。
图2 厌氧消化工艺启动过程中污染物的去除情况Fig.2 Removal performance of pollutants during the start-up of anaerobic digestion process
在 U1.c阶段(101～149 d),将HRT降低至12 h后,COD去除率明显提升,但第103 d的出水COD质量浓度又升高至897 mg/L,COD去除率降低至55%,COD去除负荷降低至2.187 kg/(m3·d)。第106 d后,微生物逐渐适应较高的进水COD去除负荷,第107～109 d出水COD质量浓度降低至745 mg/L,COD去除率恢复至63%,COD去除负荷提高至2.486 kg/(m3·d)。然而,第110 d时,反应器被打开清理霉菌后,再次引入空气,从而导致第111～114 d出水COD质量浓度升高至909 mg/L,COD去除率降低至59%。之后COD去除性能逐渐恢复。然而,过高的回流比导致UASB内厌氧消化颗粒污泥流失严重,COD去除性能难以长期保持稳定。因此,第120 d调节回流比为5.0,但回流比过低会导致颗粒污泥沉降,COD去除率从第119 d的70%迅速降低至低于60%,且第127 d添加 100 mL的厌氧消化颗粒污泥也并未明显提高COD去除性能。第135 d增大回流比至7.5,第147～149 d出水COD质量浓度降低至401 mg/L,COD去除率达到80%,COD去除负荷稳定在3.331 kg/(m3·d),说明回流比过低或过高均不适合厌氧消化工艺的启动。该阶段的总氮去除率降低为11%,再次证实了厌氧消化对总氮基本无去除能力[20],而本实验的总氮损失主要是微生物的生长及氮的逸散所致。
综上可知,间歇添加厌氧消化颗粒污泥并调节回流比为7.5有利于厌氧消化工艺的启动。
图3 不同氨氮质量浓度下COD和总氮的去除情况Fig.3 COD and total nitrogen removal status under different ammonia nitrogen mass concentrations
2.2 氨氮质量浓度对厌氧消化工艺的影响
在U1阶段末期,厌氧消化过程稳定运行,COD去除率达到80%,COD去除负荷稳定在3.331 kg/(m3·d)(指各阶段最后3 d平均值,下同)。在U2阶段(150～203 d),每10 d进水氨氮质量浓度提高200 mg/L,以考查氨氮质量浓度对厌氧消化工艺的影响情况,各污染物的去除情况见图3。由图3可知,当进水氨氮质量浓度从200 mg/L分别提高至400 mg/L、600 mg/L、800 mg/L、1000 mg/L、1200 mg/L和1400 mg/L时,各阶段末期的平均COD去除负荷从3.331 kg/(m3·d)分别变为3.520 kg/(m3·d)、3.603 kg/(m3·d)、3.603 kg/(m3·d)、3.226 kg/(m3·d)、3.221 kg/(m3·d)和3.404 kg/(m3·d)。与U1阶段末期相比,氨氮质量浓度的提高对厌氧消化过程的COD去除性能基本无影响,而当氨氮质量浓度为400～800 mg/L时,COD去除性能得到轻微促进,这与先前研究结果一致[11],低质量浓度的氨氮可作为微生物重要的营养来源,且具有一定的酸碱缓冲作用,可轻微促进厌氧消化性能。随着氨氮质量浓度的持续升高,游离氨质量浓度增大,则会抑制产甲烷微生物细胞酶活性[9]。
随着进水氨氮质量浓度逐渐提高至1400 mg/L,各阶段进水氨氮负荷从0.390 kg/(m3·d)逐渐升高至0.804 kg/(m3·d)、1.155 kg/(m3·d)、1.618 kg/(m3·d)、1.884 kg/(m3·d)、2.281 kg/(m3·d)和2.752 kg/(m3·d),总氮去除率逐渐从11%依次降低至6%、5%、8%、2%、4%和5%。进出水氨氮质量浓度的变化说明厌氧消化过程中氨氮得到有效保留,且氨氮的存在基本不影响常低温条件下厌氧消化性能,表明厌氧消化工艺适用于自养脱氮的前处理阶段。
2.3 EPS和SMP的变化情况
EPS是活性污泥和颗粒污泥中的重要组成成分,其在微生物抵抗外界环境变化和不利条件中起着重要作用[21]。EPS的主要成分与微生物细胞十分相似,主要由蛋白质和多糖组成,蛋白质是稳定细菌聚集体结构的关键因素[22],而多糖则有利于微生物的聚合并维持其完整性[23]。图4为各阶段污泥中EPS和SMP含量变化情况,其中*表示物质含量变化显著(P<0.05)。
由图4a)可知,U0、U1和U2阶段的EPS中蛋白质含量分别为24.7 mg/g SS、3.7 mg/g SS和9.3 mg/g SS,多糖含量分别为3.2 mg/g SS、0.5 mg/g SS和1.1 mg/g SS。厌氧消化工艺启动成功后,EPS中蛋白质和多糖含量均显著下降(P<0.05)。这说明随着运行条件和回流比的调整,厌氧消化微生物逐渐适应环境变化。而U2阶段的污泥样品EPS中蛋白质和多糖含量略有升高,说明随着氨氮质量浓度的升高,微生物为抵抗游离氨对自身的不利影响,增加了EPS的分泌量。
由图4b)可知,U0、U1和U2阶段的SMP中蛋白质的含量分别为1 586.5 mg/L、15.7 mg/L和50.4 mg/L,多糖含量分别为165.5 mg/L、17.9 mg/L和20.0 mg/L。SMP含量与反应器内微生物的死亡、衰竭有关[24],种泥中SMP的蛋白质和多糖含量最高,可能是由于种泥长期闲置导致基质不足,部分微生物死亡;当接种至UASB并成功启动厌氧消化工艺后,由于微生物逐渐适应反应器环境,基质充足的条件下没有大量微生物的死亡,因而SMP含量大幅减少。U2阶段SMP中蛋白质和多糖含量有所增大,说明尽管氨氮质量浓度的升高对厌氧消化性能基本没有影响,但部分厌氧微生物无法适应这种环境变化而死亡。
图4 各阶段污泥中EPS和SMP含量变化Fig.4 Variation of EPS and SMP in the sludge of each phase
2.4 微生物群落变化
各阶段污泥中微生物多样性指数和古菌优势菌群(门水平)的相对丰度见表2。由表2可知,随着运行阶段的进行,Shannon指数不断增大,而Simpson指数不断减小,说明随着厌氧消化工艺的成功启动和进水氨氮质量浓度的增大,古菌群落多样性变得更丰富;ACE和Chao指数均先降低后升高,说明厌氧消化工艺启动成功后,物种的相对丰度下降,但随着氨氮质量浓度的升高,物种丰富度有所提高。然而,各阶段污泥样品的多样性指数均较小,说明系统内古菌种类比较单一,基本为功能微生物。U0、U1和U2阶段中Euryarchaeota的相对丰度分别为85.3%、75.7%和6.4%,Halobacterota的相对丰度分别为13.3%、21.8%和92.9%。与种泥相比,厌氧消化工艺启动成功后古菌优势菌门Euryarchaeota的相对丰度下降,当升高氨氮质量浓度后进一步明显降低,说明其不适应含有氨氮基质的环境;而Halobacterota则在UASB中大量增殖,说明其更适应高质量浓度氨氮基质的环境[25]。
图5为古菌在属水平的相对丰度。由图5可知,Methanobacterium、Methanosaeta和Methanosarcina是反应器中主要的产甲烷古菌。Methanobacterium是一种典型的氢营养型产甲烷古菌[26],其在各阶段的相对丰度分别为81.0%、75.5%和6.3%。厌氧消化工艺启动成功后Methanobacterium的相对丰度略有降低,但当氨氮质量浓度从200 mg/L增加至1400 mg/L后,其相对丰度大幅降低,说明高质量浓度的氨氮会抑制其生长。Methanosaeta是一种乙酸营养型产甲烷古菌[27],各阶段的相对丰度分别为13.0%、19.8%和63.8%,说明随着氨氮质量浓度的升高,促进了该古菌的生长。然而,有研究[28]表明,在氨的抑制下,氢营养型产甲烷古菌耐受氨氮的程度接近于乙酸营养型产甲烷古菌的3倍。另有研究[29]发现,当氨氮质量浓度超过2000 mg/L时,乙酸营养型产甲烷古菌的相对丰度大幅下降,而氢营养型产甲烷古菌的相对丰度没有明显变化。以上研究与本文结果刚好相反,分析原因可能是本实验模拟废水中使用CH3COONa·3H2O提供碳源,为乙酸营养型Methanosaeta的生长提供了有利条件,从而提高了其对氨氮的耐受特性。此外,本实验在常低温条件(<25 ℃)下运行,较低的温度有利于缓解氨氮对厌氧消化功能微生物的抑制作用[11],促进Methanosaeta向优势产甲烷古菌转变。Methanosarcina是一种兼性营养型产甲烷古菌[30],能以乙酸和H2为底物产甲烷,在U0、U1和U2阶段的相对丰度分别为0、1.7%和29.1%,其相对丰度同样随氨氮质量浓度的升高而大幅上升。该结果与相关研究[31-32]结果一致,即在氨胁迫下反应器中的产甲烷古菌会由Methanosaeta向Methanosarcina演替。这说明在常低温条件下,氨氮质量浓度的升高同样会促进Methanosarcina的生长。
表2 各阶段污泥中微生物多样性指数和古菌优势菌群(门水平)的相对丰度Table 2 Microbial diversity index and relative abundance of dominant archaeal communities(phylum level) in sludge at each stage
图5 古菌属水平的相对丰度Fig.5 Relative abundances of the archaea in genus level
本文首先在UASB中启动厌氧消化工艺,然后逐渐增大氨氮质量浓度,考查常低温(<25 ℃)条件下氨氮质量浓度对厌氧消化处理模拟轻工行业废水的影响,并对反应器不同运行阶段的EPS、SMP和微生物群落演替进行分析,得到主要结论如下:
1)间歇添加厌氧消化颗粒污泥并控制回流比为7.5有利于常低温下启动厌氧消化工艺,COD去除率和COD去除负荷分别稳定在80%和3.331 kg/(m3·d)。
2)厌氧消化工艺稳定运行后,在进水pH值为7.5,HRT为12 h的条件下,氨氮质量浓度(400～1400 mg/L)对厌氧消化性能基本无不利影响,且当其质量浓度为400～800 mg/L时会轻微促进厌氧消化性能,厌氧消化工艺适用于自养脱氮的前处理阶段。
3)氨氮质量浓度的增大会促使部分微生物死亡,使EPS内蛋白质和多糖含量分别从3.7 mg/g SS和0.5 mg/g SS增加至9.3 mg/g SS和1.1 mg/g SS,SMP内蛋白质和多糖含量分别从15.7 mg/L和17.9 mg/L增加至50.4 mg/L和20.0 mg/L。
4)氨氮质量浓度的增大有利于乙酸营养型产甲烷古菌Methanosaeta和兼性营养型产甲烷古菌Methanosarcina增殖,其相对丰度分别从19.8%和1.7%增大至63.8%和29.1%,但会抑制氢营养型产甲烷古菌Methanobacterium的生长,其相对丰度从75.5%降低至6.3%。
因此,在采用厌氧消化工艺处理造纸制浆等多种轻工行业废水时,可以富集乙酸营养型产甲烷古菌Methanosaeta和兼性营养型产甲烷古菌Methanosarcina,将COD转化为甲烷回收能源,废水中残留的氨氮可采用自养脱氮工艺进一步去除,从而实现轻工行业废水的能源回收和低耗高效处理。
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