侯文燕,张营营,张龙现,张素梅
1.1 疟原虫 顶复门原虫可引起一系列严重的人类和动物疾病。例如,广泛流行于热带地区和亚热带地区的疟疾(Malaria)是人类最致命的寄生虫病之一,每年有超过 2.5 亿病例。疟疾感染是儿童死亡的主要原因之一,每年有近 100 万人感染死亡[1-2]。现有的治疗药物氯喹的耐药开始出现后,磺胺多辛-乙胺嘧啶、奎宁等也相继出现广泛耐药性,严重限制了疟疾的预防和治疗工作,并且目前在东南亚地区,疟原虫(Plasmodium)对青蒿素的敏感性已经开始降低[3],因此迫切需要新的抗疟疾药物。
1.2 弓形虫 弓形虫病(Toxoplasmosis)由刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)感染所致,呈全球性分布,弓形虫可感染包括人类在内的几乎所有温血动物,人类感染通常无症状,但当宿主进行器官移植、癌症化疗或感染艾滋病毒等免疫力低下时可重新复发[4]。人类在怀孕期间发生弓形虫急性感染时,速殖子可能会感染胎儿,导致严重的出生缺陷或造成流产[5]。在2022年关于重庆市犬和猫的弓形虫感染和流行病调查结果显示弓形虫感染率分别为20.2%和6.6%。随着动物饲养量上升,相关数据显示:全球约1/3人口的弓形虫血清抗体为阳性[6-7]。目前临床上治疗弓形虫病的标准方法为磺胺嘧啶与乙胺嘧啶联用,其他常用药物如阿奇霉素、克拉霉素、阿托伐醌和氨苯砜等,虽有一定疗效但存在毒副作用大、耐受性差等缺点,并且目前已有一些虫株产生了耐药性[8]。
1.3 隐孢子虫 隐孢子虫病(Cryptosporidiosis)是由隐孢子虫(Cryptosporidium.spp)引起的一种呈世界性流行分布的人兽共患肠道寄生虫病,是引起5岁以下儿童腹泻死亡的主要因素。在美国,早先估计每年有748 000例隐孢子虫病病例[9-10],隐孢子虫感染后免疫正常个体会引发自限性水样腹泻,但在免疫功能低下或缺陷的个体可能发生严重腹泻甚至死亡[11]。1986年,世界卫生组织将人的隐孢子虫病列为艾滋病的怀疑指标之一[12]。最常见的隐孢子虫病治疗药物有硝唑尼特和抗生素巴龙霉素,前者被美国FDA批准用于健康成人和 1 岁以上儿童,但这些药物并非对所有人群全部有效[13-15]。
目前针对顶复门原虫感染的治疗药物十分有限,现有的抗寄生虫药物多半临床应用较复杂、整体效力差、毒副作用较大,鉴于这些寄生虫具有巨大的基因组可塑性,出现耐药性的机率较大。因此,迫切需要研发新的抗寄生虫药物。双膦酸盐类(bisphosphates,BPs)药物在近几十年临床上用来预防和治疗骨质疏松症、佩吉特病(Paget’s病)、高钙血症、肿瘤骨转移等骨代谢疾病。相关研究发现,双膦酸盐类还具有抗金黄色葡萄球菌等细菌病原体以及寄生原虫如疟原虫、弓形虫、锥虫和利什曼原虫等功效[16],有望发掘成为新型抗寄生原虫药物。
双膦酸盐化合物的主要结构为两个磷酸酯基团与一个中心碳原子结合(P-C-P),除此之外双基碳上还含有R1、R2两个取代基,当R1为羟基时可增强其与羟基磷灰石的结合能力,R2则决定双膦酸盐的功效[17](如图1A所示);根据其化学结构的不同可分为两类:含氮和非含氮双磷酸盐[18]。含氮双膦酸盐抗骨吸收效果与非含氮双磷酸盐相比可扩大100至20 000倍[19-20]。焦磷酸盐是类异戊二烯合成途径中关键酶法尼基焦磷酸合酶(FPPS)的合成底物,法尼基焦磷酸合酶是生物体必不可少的类异戊二烯合成通路中重要的几种酶之一,对病原体的生长发育至关重要。但焦磷酸盐(如图1B所示)在体内易被相关酶水解,双膦酸盐是代谢稳定的焦磷酸盐类似物,且双膦酸盐的P-C-P较焦磷酸盐的P-O-P更稳定,能增加其对酶的抗性,因而双膦酸盐能够竞争性抑制生物体中法尼基焦磷酸合酶进而抑制病原体的生长。
注:A.双膦酸盐化学结构式; B.焦磷酸盐化学结构式
3.1 类异戊二烯类物质合成途径 类异戊二烯类化合物有约55 000多种分子[21],由多种脂类组成,参与生物体各种重要基本代谢,如:光合作用、呼吸作用、细胞壁生物合成、蛋白质翻译后修饰和信号转导等,同时还控制细胞壁、泛醌和色素等对病原体生存至关重要物质的合成[22]。类异戊二烯分子的生物合成途径分为两种,分别以其关键中间体命名:甲羟戊酸通路(mevalonate pathway,MVA通路)和 2C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸途径(2C-methy1-D-erythri-to1-4-phosphate pathway,MEP途径),MEP途径也称为1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸途径(1-deoxy-D-xylulose5-phosphate pathway,DOXP途径)。MVA途径存在于动物、植物和真菌在内的高等复杂生物体中,也存在一些古细菌中;而大多数细菌、藻类、高等植物等生物都利用MEP途径,如幽门螺杆菌、沙门氏菌、结核分枝杆菌、弓形虫、疟原虫等。MEP途径是重要病原体合成类异戊二烯化合物的唯一来源,且哺乳动物中不存在该途径,因此MEP途径可作为顶复门原虫的选择性药物靶点[22]。法尼基焦磷酸合酶作为顶复门原虫中MEP途径合成类异戊二烯类物质中的关键分子即为双膦酸盐的选择性靶点。
3.2 双膦酸盐抗顶复门原虫机制 尽管类异戊二烯化合物种类众多、结构和功能多样,但几乎所有类异戊二烯化合物均源于共同的两个五碳结构单位焦磷酸——异戊二烯基焦磷酸(IPP)及其异构体二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)。在顶复门原虫中,除了隐孢子虫外[23],几乎所有顶复门原虫都依赖于顶质体中的MEP途径合成和输出IPP和DMAPP(如图3所示)。MEP途径起始产物为丙酮酸和3-磷酸甘油醛,二者通过1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)、4-二磷酸胞苷基-2-甲基-D-赤藻糖醇合成酶(CMS/IspD/YgbP)、4-二磷酸胞苷基-2-甲基-D-赤藻糖醇激酶(CMK/IspE/YchB)、2-C-甲基-D-赤藻糖醇-2,4-环二磷酸合成酶(MCS/IspF/YgbB)、(E)-4-羟基-3-甲基-2-丁烯基-焦磷酸合成酶(HDS/IspG/GcpE)等多种酶的催化,经过一系列生化反应形成HMBPP,而后HMBPP经 HMBPP还原酶(HDR/IspH/LytB)以5∶1的比例同时合成IPP和DMAPP,IPP和DMAPP为类异戊二烯化合物合成的起始分子[24],至此,MEP途径在顶质体内的反应完成。
注: Pyruvate:丙酮酸;GA-3P:3-磷酸甘油醛;DXS:1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶;DOXP:1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸;DXR: 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶;MEP:2C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸;CMS/IspD/YgbP:4-二磷酸胞苷基-2-甲基-D-赤藻糖醇合成酶;CDP-ME:4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇;CMK/IspE/YchB:4-二磷酸胞苷基-2-甲基-D-赤藻糖醇激酶;CDP-MEP:4-二磷酸胞苷基-2-甲基-D-赤藻糖醇-2-磷酸;MCS/ IspF/YgbB:2-C-甲基-D-赤藻糖醇-2,4-环二磷酸合成酶;ME-cPP:2-C-甲基-D-赤藻糖醇-2,4-环二磷酸;HDS/IspG/GcpE:(E)-4-羟基-3-甲基-2-丁烯基-焦磷酸合成酶;HMBPP:(E)-4-羟基-3-甲基-2-丁烯基-焦磷酸;IspH:(E)-4-羟基-3-甲基-2-丁烯基-焦磷酸还原酶;IPP:异戊烯基焦磷酸;DMAPP:二甲基烯丙基焦磷酸;IPI:异戊烯基焦磷酸异构酶;FPPS:法尼基焦磷酸合酶;BPs:双膦酸盐;GPP:牻牛儿基焦磷酸;FPP:法尼基焦磷酸;GGPPS:牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶;GGPP:牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸;PFT:蛋白质法尼基转移酶;PGGT:蛋白质牻牛儿基转移酶;Ubiquinones:泛醌;Heme A:血红素A;Sterols:甾醇;Dolichols:多萜醇;Prenylated proteins:戊烯基化蛋白质。
IPP和DMAPP输出顶复门原虫顶质体外需进行一系列酶促反应才能形成生物体必需的多种类异戊二烯化合物,IPP和DMAPP是顶复门原虫中存在的类异戊二烯合成途径关键酶法尼基焦磷酸合酶合成底物(如图3虚线框所示)。与其宿主不同,在疟原虫中的关键酶为疟原虫法尼基焦磷酸合酶[25];在弓形虫中为弓形虫法尼基焦磷酸合酶或弓形虫香叶儿基香叶儿基焦磷酸合酶(GGPPS)[26]。而隐孢子虫在进化过程中失去了顶质体[27],尚不清楚获得IPP和DMAPP的具体途径,尽管如此,在隐孢子虫基因组中发现了三种戊烯基合成酶,这表明隐孢子虫可以获得类异戊二烯前体,IPP、牻牛儿基焦磷酸(GPP)、法尼基焦磷酸(FPP)和牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)这些前体物质可在隐孢子虫非特异性聚异戊二烯焦磷酸合酶(NPPPS)作用下生成类异戊二烯物质,非特异性聚异戊二烯焦磷酸合酶即为隐孢子虫类异戊二烯合成途径中的关键酶,并可被含氮双膦酸盐有效抑制[28]。
综上所述,上述三种顶复门原虫类异戊二烯合成途径均存在法尼基焦磷酸合酶或非特异性聚异戊二烯焦磷酸合酶等关键酶,因双膦酸盐结构与该关键酶底物焦磷酸盐相似,所以双膦酸盐可竞争性抑制顶复门原虫类异戊二烯合成途径关键酶的活性,从而影响寄生虫生存必需的类异戊二烯物质,如泛醌、血红素a、甾醇、多萜醇和戊烯基化蛋白质等的合成以及生物体的生长和能量产生、胞内信号传导和膜结构支持等生命活动。
在顶复门原虫合成类异戊二烯物质过程中,有多个具有单一功能或者非单一功能的酶参与催化反应。其中任何一种酶的功能被抑制均能干扰MEP途径合成类异戊二烯物质,因此,在该途径中针对关键酶可开发对应的抑制剂,提供多种潜在的抗顶复门原虫靶点。Beek等[29]通过使用C14标记甲羟戊酸、异戊烯基焦磷酸和二甲基烯丙基焦磷,证明了法尼基焦磷酸合酶是含氮双膦酸盐的细胞内靶标:如含氮双膦酸盐帕米磷酸钠、阿伦磷酸钠和利塞膦酸盐均被证明能有效抑制法尼基焦磷酸合酶[30-31],Moreno等[32]利用31P NMR 共振技术检测出疟原虫、弓形虫和微小隐孢子虫等顶复门原虫体内均存在大量缩合的无机磷酸盐,除隐孢子虫无顶质体外,疟原虫和弓形虫体内的无机磷酸盐均存在于其顶质体内,且该三种寄生虫的生长均可能受到双膦酸盐的抑制。另外,Van等[29]通过使用14C同位素标记甲羟戊酸、IPP和DMAPP,证实法尼基焦磷酸合酶是双膦酸盐的靶标。这充分证明了双膦酸盐能够利用其结构优势竞争性抑制顶复门原虫体内的法尼基焦磷酸合酶从而抑制其生长。
4.1 双膦酸盐化合物抗疟原虫研究进展 疟疾是由疟原虫传播引起的影响全球人类健康的虫媒病,目前对其传播无有效阻断方法。已有数据表明疟原虫体内的法尼基焦磷酸合酶能被其底物焦磷酸盐类似物——双膦酸盐化合物有效抑制[33]。相关研究表明,双膦酸盐化合物利塞膦酸对恶性疟原虫血液阶段半数抑制浓度为20.3 μmol/L,且可抑制法尼基焦磷酸基团向寄生虫蛋白转移,体外结果显示利塞膦酸可抑制疟原虫生长,在利塞膦酸盐存在的情况下在培养基中添加法尼基焦磷酸合酶底物IPP,疟原虫生长未恢复,但添加其下游产物FPP 或 GGPP 可有效恢复疟原虫的生长。此研究结果表明法尼基焦磷酸合酶是双膦酸盐作用靶点[34]。Martin等[35]测定了19 种双膦酸盐对恶性疟原虫和刚地弓形虫的抑制作用,经过比对发现不含氮的双膦酸盐具有较高活性,而对于恶性疟原虫,含有简单芳基或烷基的双膦酸盐的IC50比含氮双膦酸盐低 10到20倍,以上研究表明:双膦酸盐结构不同可导致其对寄生虫作用位点或结果有所差异。
4.2 双膦酸盐抗弓形虫研究进展 双膦酸盐可抑制类异戊二烯通路,并已被证明能有效抑制弓形虫生长[36-37]。Yardley等[38]使用10 mg/kg、20 mg/kg的利塞膦酸腹腔注射10 d,用于感染弓形虫BALB/c小鼠的治疗研究,结果显示所有未经治疗的对照组小鼠均于感染后16 d死亡,平均存活时间为12.7 d;而利塞膦酸 10 mg/kg治疗组小鼠存活率为35%,平均存活时间为20.3 d;利塞膦酸20 mg/kg治疗组存活率为55%,平均存活时间为22.1 d,表明利塞膦酸不能防止小鼠弓形虫感染但可有效提升小鼠存活率。Szajnman等[39]研究结果显示含砜化合物1-[(正癸基磺酰基)乙基]-1,1-双膦酸对细胞内弓形虫速殖子半数抑制浓度EC50为0.11 μmol/L,该化合物在组织培养中毒性较低,选择性指数高于2 000,其在治疗弓形虫病小鼠模型中也显示出高活性。该化合物对弓形虫法尼基焦磷酸合酶的IC50高于其EC50,且其对恶性疟原虫和微小隐孢子虫的EC50分别为0.6 μmol/L和65 μmol/L,表明该含砜双膦酸是一种较好的抗寄生虫新型药物。Ling等[40]测定了60 种双膦酸盐对弓形虫体外增殖的总体活性范围为 280 nmol/L至 235 μmol/L,前10种最有效化合物的IC50均小于10 μmol/L,且该10种化合物中有7/10为含氮双膦酸盐,而后在弓形虫感染小鼠模型中测试3种最有效的含氮烷基双膦酸盐,感染弓形虫3 d后3种化合物分别以 5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg腹腔注射治疗10 d,结果表明10 mg/kg的化合物1和5 mg/kg的化合物2可以保护80%的小鼠防止因感染死亡;而对照药含氮双膦酸盐利塞磷酸只提供了约55%的保护率,且利塞磷酸的治疗指数(100)远低于该两种含氮烷基双膦酸盐(1 600),作者推测含氮烷基双膦酸盐的较高保护作用与其治疗指数有关。而后Moreno等[26]研究了60种双膦酸盐抗弓形虫的功效,结果发现两种最有效的化合物为长碳链(n=9或10)的含氮烷基双膦酸盐,验证了以上Ling等人研究的含氮烷基双膦酸盐对弓形虫的感染具有较好保护的结果。除此之外,Li等[41]发现双膦酸盐联合用药可有较高协同作用,在体外实验显示,含硫线性双膦酸盐中的一个衍生物1-[(正庚硫基)乙基]-1,1-双膦(简称C7S)与多种他汀类药物(西立伐他汀、匹伐他汀、阿托伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀、美伐他汀)具有协同作用,而后以低剂量的阿托伐他汀(1.25 mg/kg/d)分别和C7S(0.03 mg/kg/d)、唑来膦酸(0.01 mg/kg/d)、利塞膦酸(0.01 mg/kg/d)联合用药或单药治疗弓形虫感染的小鼠,结果表明单药使用在感染后30d无明显显著保护作用,而联合用药组在相同条件下显示60%至80%的保护作用,表明低剂量的双膦酸盐和他汀类药物联合用药可起到更强的协同作用,并且联合用药剂量极低,可显著降低药物毒副作用。而先前报道市售双膦酸盐仅唑来膦酸与他汀类药物之间有一定的协同作用。此外,双膦酸盐已被证明易积聚在寄生虫感染的组织如肝脏和脾,浓度分别达到血浆浓度的140和814倍,并具有一定免疫调节作用[42]。以上研究表明,多种双膦酸盐尤其是含氮烷基双膦酸盐可有效降低弓形虫感染。
4.3 双膦酸抗隐孢子虫研究进展 在顶复门原虫中隐孢子虫结构较为特殊,其在进化过程中丢失了顶质体[27],但Moreno等[32]利用31P NMR 共振技术检测到微小隐孢子虫中存在大量缩合磷酸盐和焦磷酸盐,表明焦磷酸盐类似物可能抑制微小隐孢子虫生长。随后作者使用小鼠异种移植模型检测100 μmol/L的利塞膦酸对微小隐孢子虫增殖的影响,发现在利塞膦酸处理过72 h后的小鼠异种移模型中未检测到寄生虫。此外,将100 μmol/L的利塞膦酸盐添加到部分脱囊的微小隐孢子虫卵囊中不会导致子孢子活力的丧失,表明利塞膦酸作为焦磷酸盐类似物可有效抑制微小隐孢子虫的生长阶段。Artz等[28]证明了含氮双膦酸盐能够在受感染的 MDCK 细胞中以低浓度抑制隐孢子虫生长发育。通过免疫荧光标记分析了含氮双膦酸盐对微小隐孢子虫在 MDCK 细胞中生长的影响:帕米膦酸盐和NE10790的IC50分别为 12.1 μmol/L和52.3 μmol/L,其数量级与巴龙霉素相同,而利塞膦酸、唑来膦酸和伊班膦酸显示出较强的活性,其IC50低至3到6 μmol/L,比巴龙霉素的抑制效力强一个数量级以上,其作用机制是抑制类异戊二烯的生物合成,靶标酶是一种独特的微小隐孢子虫酶,称为非特异性聚异戊二烯焦磷酸合酶。该酶产生各种大于 FPP 的类异戊二烯产物,并在亚纳摩尔浓度下被含氮双膦酸盐抑制,且该机制得到了与利塞膦酸盐和唑来膦酸盐所结合的酶的晶体结构证实。Bessoff等[43]用伊伐他汀抑制宿主甲戊酸途径,减少IPP合成而阻断微小隐孢子虫的生长,而培养基中添加IPP可恢复部分微小隐孢子虫的生长。这表明微小隐孢子虫依赖于宿主通过甲羟戊酸途径合成产生的IPP合成必需的类异戊二烯化合物。
顶复门原虫包括全球性的最普遍和最致命的人类病原体,严重威胁人类和动物健康,迫切需要新的抗寄生虫药物。现有治疗方法和药物多半有毒副作用或一定的耐药性。目前,干扰类异戊二烯代谢途径已被证明是预防和治疗病原微生物疾病的一种有效方法。与疟原虫和弓形虫不同,隐孢子虫在进化过程中丢失了顶质体不能从头合成类异戊二烯物质,其特殊的合成途径尚不清楚,有待进一步深入研究。双膦酸盐在临床上已成熟应用于治疗骨代谢疾病,具有很好的安全性、开发空间较大。且顶复门原虫体内的戊烯基合酶具有特殊的结构特性,可结合不同链长底物,同时双膦酸化合物侧链结构的微小变化均可影响其吸收能力和作用效果,以此可扩大双膦酸类及相关抑制剂的储备。因此,双膦酸盐有望发掘成为新型抗原虫药物。
利益冲突：无
引用本文格式：侯文燕,张营营,张龙现,等.双膦酸盐抗三种顶复门原虫研究进展[J].中国人兽共患病学报,2024,40(2):185-190,196. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2024.00.029
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