江林琪 赵佳莹 郑飞雄 姚馨怡 李效贤 俞振明，2
（1.浙江中医药大学药学院，杭州 311402；
2.浙江中医药大学中医药科学院，杭州 310053）
随着全球环境气候的变化，植物因其固着生长的属性而无法规避所受到的环境胁迫，具有应对低温、干旱和盐碱等非生物胁迫的特质已逐渐成为影响植物正常生长发育的关键要素［1］。铁皮石斛（Dendrobium officinale）是兰科（Orchidaceae）石斛属（Dendrobium）多年生草本植物，是我国传统的名贵滋补中药材，被誉为“药界大熊猫”。铁皮石斛以茎入药，可益胃生津，滋阴清热；
叶片可制作成食品，具有降脂的疗效；
花可制作成花草茶，具有降血糖及抗氧化的功效［2］。但由于铁皮石斛对生存环境的需求较为严苛，极易受到干旱、盐碱以及极端温度等逆境胁迫的影响［3-4］，从而损害植物的生长发育。
14‑3‑3 蛋 白，又 称 通 用 调 节 因 子（general regulatory factor, GRF），以多基因家族形式广泛存在于真核生物中且高度保守［5］。14‑3‑3 蛋白最早发现于牛脑组织细胞中，因其在二乙氨乙基纤维素层析后的片段数量及在凝胶电泳中的迁移率而得名。植物14‑3‑3 蛋白依据序列同源性分为ε 类（epsilon group）和非ε 类（non‑epsilon group），它们通过不同策略与靶蛋白相互作用，参与植物生长发育、激素信号转导、营养代谢调控、逆境胁迫应答等诸多调控过程［6-8］。
随着基因组测序飞速发展，大量植物14‑3‑3 家族成员在基因组层面得以鉴定，例如辣椒（Capsicum annuum）［9］、马铃薯（Solanum tuberosum）［10］、黄瓜（Cucumis sativus）［11］、 水 稻（Oryza sativa）［12］、木 薯（Manihot esculenta）［13］、 茶 树（Camellia sinensis）［14］等，表明植物14‑3‑3 蛋白在不同物种中广泛存在，但这些基因在不同组织器官、外源激素及非生物胁迫下存在差异化的表达规律［15］，这与其氨基酸序列N 端和C 端的高度变异性息息相关。在水稻、大麦（Hordeum vulgare）、高粱（Sorghum bicolor）等禾本科植物中，GRF 家族成员响应脱落 酸（abscisic acid, ABA）、 茉 莉 酸 甲 酯（methyl jasmonate, MeJA）、 赤 霉 素（gibberellin, GA）、 吲哚‑3‑乙酸（indole‑3‑acetic acid, IAA）等多种外源激素处理，影响植物的生长发育及对逆境胁迫的应答过程［16］。拟南芥14‑3‑3λ 蛋白与蛋白激酶SOS2‑like protein kinase 5 互作受钙信号Ca2+激活调控并充当分子开关作用，进而被盐胁迫信号激活，协同介导质膜H+‑ATPase 活性来调控钠离子Na+稳态，提高拟南芥对盐胁迫的耐受性［17］。在拟南芥中过量表达苹果（Malus domestica）MdGRF13 基因能够显著提高转基因株系中过氧化酶（peroxidase, POD）、过氧化氢酶（catalase, CAT）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）的活性水平，降低叶片相对电导率及丙二醛（malondialdehyde, MDA）含量，最终增强转基因株系对盐胁迫和干旱胁迫的耐受能力［6］。然而截至目前对GRF 家族蛋白的研究主要聚焦于模式植物，铁皮石斛14‑3‑3 基因家族及其成员的表达特征尚不清楚。
为研究GRF 蛋白在铁皮石斛生长发育及逆境应答中的生物学功能，本研究基于铁皮石斛染色体级别的基因组［4］，利用生物信息学方法，对铁皮石斛14‑3‑3 基因家族进行全基因组鉴定，并对它们的理化性质、保守基序、进化关系、染色体定位，及在不同组织器官、低温处理、盐胁迫处理的表达水平进行分析，为进一步研究铁皮石斛GRF 蛋白的功能提供理论依据。
1.1 材料
铁皮石斛（D.officinale）采收自浙江中医药大学富春校区药用植物园（E119.89, N30.08），于2022年6 月铁皮石斛开花期间采收根（根、根尖和气生根）、茎、叶、花（花蕾、萼片、唇瓣、花粉、合蕊柱）等不同器官，用于分析DoGRF1-DoGRF17 基因在不同组织器官的表达水平。铁皮石斛组培苗培养条件与先前报道相一致［18］，6 月龄的组培苗转接至250 mmol/L NaCl 的1/2 MS 培养基中，在25℃，16 h /8 h（光照/黑暗交替），光照强度为100 mmol/(m2·s)的人工气候室中培养，分别在0、4、12 h 后收集铁皮石斛的叶和根［19］，用于分析DoGRF1-DoGRF17 基因响应盐胁迫的表达水平。铁皮石斛组培苗转移至0℃培养箱，以人工气候室中样品为对照，6 h 后收集叶片，用于分析DoGRF1-DoGRF17 基因响应低温的表达水平。以上样品经液氮速冻后，均保存于‑80℃冰箱备用。
1.2 方法
1.2.1 铁皮石斛14‑3‑3 基因家族的挖掘与鉴定 在TAIR 网站（http://www.arabidopsis.org/）下载已公布的13 条拟南芥14‑3‑3 蛋白序列作为种子序列，在铁皮石斛基因组［4］中通过BLAST 筛选（E‑value ＜1e-5）并挖掘14‑3‑3 同源序列。通过NCBI‑CDD 工具［20］对上述获取的蛋白序列进一步筛选并获得候选14‑3‑3。同时，对候选序列进行保守结构域完整性的鉴定，在Pfam 网站（https://pfam.xfam.org）下载14‑3‑3 的保守结构域（PF00244），利用HMMER软件［21］，验证铁皮石斛基因组中的14‑3‑3 候选成员。最终鉴定到17 条14‑3‑3 家族成员，据其在染色体上的位置命名为DoGRF1-DoGRF17。
1.2.2 铁皮石斛14‑3‑3 家族成员理化性质、染色体定位及亚细胞定位预测 利用ExPASy 网站（http://cn.expasy.org/tools）分析铁皮石斛DoGRF1-DoGRF17的氨基酸数目、分子量、等电点、不稳定系数、脂肪系数和总平均亲水指数等理化性质。通过BUSCA在 线 网 站（http://busca.biocomp.unibo.it/） 预 测DoGRF1-DoGRF17 蛋白的亚细胞定位。利用工具SOPMA（https://npsa‑prabi.ibcp.fr/） 预 测DoGRF1-DoGRF17 蛋白的二级结构。利用铁皮石斛基因组注释文件获取DoGRF1-DoGRF17 基因在染色体上的位置信息，通过TBtools 软件［22］将DoGRF1-DoGRF17基因映射到染色体上，可视化基因的染色体定位。
1.2.3 铁皮石斛14‑3‑3 家族成员的系统进化树分析 通过Phytozome 网站（http://www.phytozome.net）下载拟南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻、大豆（Glycine max）、非洲菊（Gerbera hybrida）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）中已报道的14‑3‑3 蛋白序列，用于构建系统进化树。将铁皮石斛DoGRF1-DoGRF17 与上述5 种植物的14‑3‑3 蛋白序列进行多重序列比对，采用MEGA X 软件［23］的NJ 法构建铁皮石斛DoGRF家族成员的系统进化树，Boostrap 值设置为1 000，其余默认参数。
1.2.4 分析铁皮石斛14‑3‑3 家族的保守基序及基因结构 通过MEME 在线网站（https://meme‑suite.org）分析铁皮石斛DoGRF1-DoGRF17 序列的保守基序，将motif 查找数量定为10，通过TBtools 软件将保守基序结果进行可视化。
通过铁皮石斛基因组的注释文件获取DoGRF1-DoGRF17 基因外显子和内含子的位置信息，利用GSDS 网 站（http://gsds.gao‑lab.org/）绘 制DoGRF1-DoGRF17 基因的结构特征。
1.2.5 分析铁皮石斛14‑3‑3 家族基因启动子的顺式作用元件 利用PlantCARE 网站（https://bioinformat‑ics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）检索铁皮石斛DoGRF1-DoGRF17 基因启动子前2 000 bp 的顺式作用元件，利用TBtools 软件［22］对逆境响应相关顺式作用元件进行可视化。
1.2.6 分析铁皮石斛14‑3‑3 家族基因在不同组织器官的表达水平 为研究铁皮石斛DoGRF 基因家族在不同组织器官的表达模式，从NCBI 下载铁皮石斛茎、叶、花蕾、萼片、唇瓣、花粉、合蕊柱、根、根尖、气生根的RNA‑seq 数据［24］，通过HISAT、StringTie和Ballgown 软件［25］组装与评估转录本，并获得铁皮石斛在不同组织器官的表达量，最终利用TBtools软件［22］可视化DoGRF1-DoGRF17 基因的表达水平。
1.2.7 分析铁皮石斛14‑3‑3 家族基因在低温及盐胁迫处理下的表达水平 采用多糖多酚植物RNA提取试剂盒（0416‑50, 北京华越洋生物科技有限公司）参照说明书分别提取受低温处理的铁皮石斛叶，及盐胁迫处理的根和叶总RNA［26］，通过NanoDrop2000 分光光度计（Thermo Fisher Scientific,美国马萨诸塞州）检测所得总RNA 的浓度和质量。按照PrimeScriptTMRT reagent Kit（RR047A, TaKaRa,中国大连）进行反转录合成cDNA，所得的cDNA 分析DoGRF1-DoGRF17 基因在低温及盐胁迫处理下的表达水平。
选 择 铁 皮 石 斛EF‑1α 为 内 参 基 因［27］，利 用Primer Premier 5.0 设计DoGRF1-DoGRF17 基因的荧光定量PCR 引物（表1）。将低温及盐胁迫处理下铁皮石斛根或叶的cDNA 质量浓度定量为50 ng/μL，按照iTaqTMuniversal SYBR®Green（1725121, Bio‑Rad Laboratories, 美国加利福尼亚州）操作说明在ABI 7500 荧光定量PCR 仪（Applied Biosystems, 美国加利福尼亚州）上进行定量PCR 反应。反应体系（10 μL）为iTaqTMuniversal SYBR®Green supermix 5 μL，上、下游引物（10 mmol/L）各0.5 μL，cDNA 模板1 μL,ddH2O 3 μL。反应程序为95℃预变性30 s，及40 个扩增循环（95℃变性10 s，60℃退火30 s）。每个处理的样品含3 个生物学重复。利用2-ΔΔCt法［28］计算铁皮石斛DoGRF1-DoGRF17 在低温及盐胁迫处理下的相对表达量，通过Student’s t‑test 比较处理组与对照组间的显著性。
表1 本实验所用的引物序列Table 1 Primer sequences used in this study
2.1 铁皮石斛14‑3‑3家族基因的鉴定及理化分析
通过生物信息学方法，在铁皮石斛基因组中共鉴定到17 个14‑3‑3 家族成员，根据这些基因所在的亚家族及染色体上的位置命名为DoGRF1-DoGRF17（表2）。ExPASy 分析结果发现，17 个铁皮石斛DoGRF 成员的氨基酸数介于144-299 aa，最大的为DoGRF2；
分子量为16.29-34.17 kD，平均分子量为28.77 kD；
等电点介于4.73-9.03 之间，平均值为5.84；
不稳定系数介于39.17-51.58，脂肪系数介于91.80‑103.33；
DoGRF1-DoGRF17蛋白均具有较强的亲水性，以DoGRF16 蛋白的亲水性最强。亚细胞定位预测显示，DoGRF13 和DoGRF17 定位于叶绿体，其余15个DoGRF 成员均定位在细胞核上。
表2 铁皮石斛DoGRF 蛋白的理化性质分析Table 2 Physicochemical properties of DoGRF proteins in D.officinale
2.2 铁皮石斛14‑3‑3家族基因的染色体定位分析
根据铁皮石斛全基因组注释结果，绘制了DoGRF 家族成员的染色体定位图谱（图1‑A）。结果显示，除DoGRF17 未锚定到特定的染色体外，其余16 个DoGRF 成员不均匀地分布在Chr1、Chr5、Chr7、Chr10、Chr12、Chr16 和Chr17 这7 条染色体上，Chr12 染色体上有3 个（DoGRF9、DoGRF10、DoGRF11），Chr16 染色体上也有3 个（DoGRF12、DoGRF13、DoGRF14），Chr1、Chr5、Chr7、Chr10和Chr17 染色体上分别存在2 个不同的成员。
图1 铁皮石斛DoGRF 家族成员的染色体定位（A）及复制事件分析（B）Fig.1 Chromosomal localization（A）and replication events（B）of the DoGRF family members in D.officinale
进一步研究了DoGRF 家族基因间的共线性关系（图1‑B），结果显示，7 对DoGRF 基因有共线性关系，DoGRF1 和DoGRF5、DoGRF2 和DoGRF6、DoGRF2 和DoGRF8、DoGRF3 和DoGRF16、DoGRF4和DoGRF12、DoGRF6 和DoGRF7、DoGRF13 和DoGRF15 互为串联复制基因对，说明DoGRF 家族成员在进化过程中发生了染色体片段复制事件。
2.3 铁皮石斛14‑3‑3家族成员的系统发育树分析
通过DNAMAN 软件对17 个铁皮石斛14‑3‑3 家族蛋白进行多重序列比对（图2），结果显示，它们具 有 保 守 的14‑3‑3 结 构 域（LGLALNFSVFYYEI），序列一致性达到55.05%，中间区域的序列相似度较高，尤其是红色框内的序列，它们均是14‑3‑3 蛋白的保守核心区。N 端和C 端的序列变异程度较大，这可能是造成DoGRF 成员存在功能差异的原因。
图2 铁皮石斛DoGRF 家族蛋白的多重序列比对Fig.2 Multiple sequence alignment of the DoGRF family proteins in D.officinale
为了分析GRF 蛋白间的系统进化关系，通过MEGA 软件绘制了铁皮石斛、水稻、拟南芥、大豆、蒺藜苜蓿、非洲菊中的73 条GRF 蛋白序列的系统发育树（图3），结果显示，所有14‑3‑3 蛋白主要分为ε-type group 和non ε-type group 两大分支，8个 成 员（DoGRF1、DoGRF5、DoGRF6、DoGRF8、DoGRF14、DoGRF15、DoGRF16、DoGRF17） 隶属ε-type group， 其 余 的9 个 成 员（DoGRF2、DoGRF3、DoGRF4、DoGRF7、DoGRF9、DoGRF10、DoGRF11、DoGRF12、DoGRF13） 隶 属non ε-type group。铁皮石斛DoGRF 蛋白与单子叶植物水稻GRF 蛋白的亲缘关系相对较近，与双子叶植物拟南芥、大豆、蒺藜苜蓿、非洲菊中GRF 蛋白的亲缘关系相对较远，推测可能是植物14‑3‑3 蛋白在单子叶植物与双子叶植物是平行进化的两支，形成了相对独立的类群。
图3 铁皮石斛、水稻、拟南芥、大豆、蒺藜苜蓿、非洲菊GRF 家族成员的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of GRF family members in D.officinale, O.sativa, A.thaliana, G.max, M.truncatula and G.hybrida
2.4 铁皮石斛14‑3‑3家族成员的保守基序和基因结构分析
基于铁皮石斛全基因组的注释文件，绘制了DoGRF 家族成员的基因结构（图4‑A），结果显 示，6 个 成 员（DoGRF4、DoGRF5、DoGRF14、DoGRF15、DoGRF16、DoGRF17）不 含 非 编 码 区（untranslated regions, UTR），其余成员均含有3"‑UTR和5"‑UTR。所有DoGRF 家族成员含2-7 个编码区（coding region, CDS），DoGRF10 长度达到71 550 bp，含有5 个CDS 和2 个UTR，而DoGRF14 长度仅为972 bp，含有2 个CDS。
图4 铁皮石斛DoGRF 家族成员的基因结构（A）、保守基序（B）及基序标识（C）Fig.4 Gene structure（A）, conserved motifs（B）, and motif logo（C）of DoGRF family members in D.officinale
铁皮石斛DoGRF 家族成员中鉴定到8 个保守基序（图4‑B-C），结果显示，所有成员均存在motif 2（含KMKGDY 序列）和6，非ε 类DoGRF 成员含有7 个保守基序，ε 类DoGRF 成员含有2-7 个保守基序，聚类在同一分支上的DoGRF 成员具有类似的保守基序，motif 8 仅分布在DoGRF15、DoGRF16 和DoGRF17 中。
2.5 铁皮石斛14‑3‑3家族成员的二级结构分析
通过SOMPA 软件分析了DoGRF 家族蛋白的二级结构（表3），结果显示，DoGRF 家族成员均有α-螺旋、β-折叠、延伸链和随机卷曲4 种二级结构类型，所占比例大小依次为α-螺旋（平均51.02%）、随机卷曲（平均31.05%）、延伸链（平均12.63%）和β-折叠（平均5.29%）。DoGRF6 的α-螺旋占比（67.43%）最大，DoGRF13 的延伸链占比（16.28%）最大，DoGRF14 的随机卷曲（38.46%）和β-折叠（10.65%）占比最大。
表3 铁皮石斛DoGRF 成员的蛋白二级结构分析Table 3 Analysis of secondary structure of DoGRF proteins in D.officinale
2.6 铁皮石斛14‑3‑3家族基因的启动子顺式作用元件分析
利用PlantCARE 网站分析了铁皮石斛DoGRF 家族基因启动子上的顺式作用元件及其响应激素和非生物胁迫的功能，获得9 个顺式作用元件（水杨酸响应、光照响应、生长素响应、低温响应、茉莉酸响应、赤霉素响应、干旱诱导、脱落酸响应、防御与胁迫）并将其可视化（图5）。结果显示，DoGRF1和DoGRF17 启动子上存在上述9 种顺式作用元件，而DoGRF14 启动子上仅含1 种顺式作用元件（光照响应）。94.1%的DoGRF 成员的启动子上含有光照响应元件（DoGRF4 除外），76.5%的DoGRF 成员的启动子上含有茉莉酸响应元件（DoGRF4、DoGRF6、DoGRF10、DoGRF14 除外）。此外，还有10 个、9个、11 个DoGRF 成员的启动子上分别含有低温响应、脱落酸响应和水杨酸响应元件，暗示大多数DoGRF家族成员能够响应植物激素的处理，并受环境胁迫应答的诱导。
图5 铁皮石斛DoGRF 家族基因启动子的顺式作用元件分析Fig.5 Analysis of cis-regulatory elements on the promoters of DoGRF family genes in D.officinale
2.7 铁皮石斛14‑3‑3家族基因的组织表达特性分析
为了明晰铁皮石斛DoGRF 成员在不同组织中的表达特征，通过已公布转录组［22］分析了17 个DoGRF 家族基因在铁皮石斛花蕾（flower bud）、萼片（sepal）、 唇 瓣（labellum）、 花 粉（pollinium）、合 蕊 柱（gynostemium）、 茎（stem）、 叶（leaf）、根（root）、绿色根尖（green root tip）、白色气生根（white part root）中的表达量，结果（图6）显示，DoGRF 家族成员在所有组织中均有表达，但具有组织表达特异性且成员间的表达水平存在差异，有5个 基 因（DoGRF6、DoGRF7、DoGRF8、DoGRF9、DoGRF11）在茎中的表达量最高，有2 个基因（DoGRF2、DoGRF5）在根中的表达量最高，其余10 个DoGRF 基 因（DoGRF1、DoGRF3、DoGRF4、DoGRF10、DoGRF12、DoGRF13、DoGRF14、DoGRF15、DoGRF16、DoGRF17）均在花粉中的表达量最高，暗示它们在花器官发育中可能起重要的作用。
图6 铁皮石斛DoGRF 家族基因的组织特异性表达分析Fig.6 Tissue specific expression analysis of DoGRF family genes in D.officinale
2.8 铁皮石斛14‑3‑3家族基因在非生物胁迫下的表达模式分析
基于大多数DoGRF 家族成员的启动子上含有逆境响应元件（图5），分析了DoGRF 家族基因在非生物胁迫（低温和盐胁迫）下的表达水平，结果（图7）显示，共有10 个基因（DoGRF1、DoGRF3、DoGRF5、DoGRF6、DoGRF8、DoGRF9、DoGRF12、DoGRF15、DoGRF16、DoGRF17）在铁皮石斛叶低温处理后呈现下调表达；
其余7 个基因（DoGRF2、DoGRF4、DoGRF7、DoGRF10、DoGRF11、DoGRF13、DoGRF14）在铁皮石斛叶低温处理后呈现上调表达。
图7 铁皮石斛DoGRF 家族基因在低温处理下的表达水平Fig.7 Expressions of DoGRF family genes under low-temperature stress in D.officinale
此外，分析了铁皮石斛叶片和根中DoGRF 家族基因响应盐胁迫处理的表达水平，结果（图8）显示，盐胁迫处理下，DoGRF12、DoGRF15、DoGRF17在叶片中的表达量没有显著性差异，DoGRF5、DoGRF6、DoGRF9 在根系中的表达量没有显著性差异。在叶片中，共有4 类基因表达的模式：7 个基因（DoGRF1、DoGRF2、DoGRF5、DoGRF8、DoGRF9、DoGRF10、DoGRF16）呈现不断上调表达；
2 个基因（DoGRF6、DoGRF14）呈现不断下调表达；
3 个基因（DoGRF7、DoGRF11、DoGRF13）呈现先减少后增加的表达趋势；
2 个基因（DoGRF3、DoGRF4）呈现先增加后减少的表达趋势。在根中，盐胁迫处 理 后6 个 基 因（DoGRF1、DoGRF7、DoGRF8、DoGRF10、DoGRF11、DoGRF12）的表达量明显降低，8 个基因（DoGRF2、DoGRF3、DoGRF4、DoGRF13、DoGRF14、DoGRF15、DoGRF16、DoGRF17） 的 表达量明显增加。
铁皮石斛染色体级别基因组的发布为抗逆基因挖掘及其进化提供了重要的遗传信息［4］。真核生物中高度保守的14‑3‑3（GRF）家族蛋白通过磷酸化修饰调控靶蛋白活性，在植物生长发育、代谢产物合成和环境胁迫应答中发挥关键作用［5］。本研究共在铁皮石斛基因组中鉴定到17 个DoGRF 家族成员，比拟南芥（13 个）［9］、水稻（8 个）［12］、辣椒（15个）［9］、番茄（Solanum lycopersicum; 12 个）［29］、二穗短柄草（Brachypodium distachyon; 12 个）［15］中的数量多，比大豆（18 个）［11］、苹果（18 个）［30］中的数量少，表明铁皮石斛中的14‑3‑3 家族有所扩张，这可能与铁皮石斛普遍适应低温、干旱、强光照等逆境的需求相关。此外，DoGRF17 未锚定到染色体上，其余16 个DoGRF 成员不均匀定位在7 条染色体上，每条染色体上含有2-3 个成员，并且存在7对串联复制基因具有同源进化关系，包括串联和节段复制，表明铁皮石斛DoGRF 基因家族的扩增可能是由基因复制事件造成的［14］。
铁皮石斛17 个DoGRF 成员均具有14‑3‑3 家族的保守功能域（PF00244），氨基酸平均数为256，分子量平均数为28.77 kD，pI 平均值为5.84，这与其他物种中GRF 蛋白分子量约30 kD，且为酸性蛋白质氨基酸（pI ＜ 7.0）相一致［11-13］，表明GRF 家族蛋白在植物中相对保守。DoGRF 家族蛋白均是亲水蛋白，暗示它们在响应环境胁迫应答中发挥重要的作用，二级结构以具有刚性的α-螺旋为主（平均占比51.02%），为蛋白质的构象提供支撑力［7］。
根据系统进化分析，DoGRF 家族成员分为ε-type和non ε-type 两大亚族，与单子叶水稻亲缘关系相对较近，与双子叶拟南芥、大豆亲缘关系相对较远，与早期植物GRF 蛋白进化为两支的观点相一致［8］。单子叶与双子叶植物中的GRF 成员在进化上相对独立且保守，具有不同的路径和进化趋势，进而呈现2 个相对独立的平行进化类群［13］。GRF 家族蛋白序列中间的motif 2 和motif 6 在DoGRF 家族中高度保守，N 端和C 端的变异性较大，C‑端α7-α9 螺旋上的疏水残基通过非磷酸化识别序列与靶蛋白直接互作。N‑端12-30 氨基酸残基对蛋白二聚体形成及配体偶联起着关键的作用，进而影响与受体膜的识别，是导致GRF 蛋白功能多样性和复杂性的基础［5-7］。
铁皮石斛DoGRF 家族基因的表达具有组织特异性，在铁皮石斛花蕾、萼片、唇瓣、花粉、合蕊柱、茎、叶、根、绿色根尖、白色气生根中呈现差异性的表达，10 个基因在花中表达最高，其次是茎（5 个）和根（2个），推测DoGRF 基因在调控不同组织的生长发育中发生了功能的分化。
启动子区域存在大量的顺式作用元件，对基因的转录和表达具有显著影响。多种非生物（高盐、低温、干旱）逆境能诱导14‑3‑3 基因的表达，其启动子上游的顺式元件对其表达量起着至关重要影响［15-16］。铁皮石斛DoGRF 家族基因启动子区域富集了大量脱落酸、茉莉酸等激素响应元件，及低温、干旱诱导等逆境响应元件。各个成员包含的元件数量与种类也存在差异，推测铁皮石斛DoGRF 家族基因的表达可能与激素诱导及抗逆应答有关，与辣椒［9］、茶树［14］、苹果［30］等GRF 蛋白响应非生物胁迫相一致。
实验结果表明，多类非生物胁迫（如低温、盐胁迫）可诱导不同DoGRF 基因的表达，低温处理促进7 个DoGRF 基因显著上调表达，盐胁迫处理促进叶中7 个DoGRF 基因显著上调表达，根中8 个DoGRF 基因显著上调表达。GRF 蛋白响应低温应答的研究主要聚焦在拟南芥中，受体激酶CRPK1 负调控植物的低温耐受性，可被低温激活并磷酸化14‑3‑3λ 蛋白，促使14‑3‑3λ 蛋白由细胞质进入细胞核，与CBF3 蛋白互作致其泛素化降解，进而不利于植物耐受低温胁迫［31］。在盐胁迫诱导下，水稻幼苗及愈伤组织中GRF 蛋白的表达水平明显增加［12］。过表达OsGF14b 基因促进水稻耐盐性显著增加，敲除该基因使其对盐胁迫相当敏感，并且盐胁迫有利于OsGF14b 与OsPLC1 互作，抑制OsPLC1 的泛素化降解，促进三磷酸肌醇和二酰甘油的生成，激活胞内Ca2+信号从而提高水稻的耐盐性［32］。有趣的是，铁皮石斛DoGRF2 基因同时被低温和盐胁迫处理诱导表达，这与该基因的启动子区域鉴定到的低温响应、防御与胁迫元件相吻合［7-8］，具体的分子机制有待进一步研究。
本研究在铁皮石斛中共鉴定出17 个14‑3‑3（GRF）家族基因，编码144-299 个氨基酸，分为ε类和非ε 类，分布在7 条染色体上，含高度保守的motif 2 和motif 6，N 端和C 端变异性较大。该家族基因启动子上富集大量的激素和逆境应答相关的顺式元件。DoGRF 家族基因在各个组织均有表达，具有组织特异性，并在低温及盐胁迫下存在差异表达，暗示它们广泛参与非生物胁迫。
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