石一凡,李晓彤,锁云鹏,刘俊泽,李春梅,李延森
(南京农业大学动物科技学院家畜环境控制与智慧生产研究中心,江苏 南京 210095)
近年,高度集约化和规模化养殖方式迅速发展,畜禽饲养密度较高,夏季高温引起的热应激非常普遍,已成为畜牧业养殖中备受关注的问题之一[1]。雄性家畜,如猪、牛、羊睾丸悬浮在体腔外,环境高温可直接使其温度升高,与其他器官相比,睾丸更容易受到热应激的影响[2]。睾丸温度过高不利于精子生成,导致精子活力降低,附睾精子和睾丸生精细胞都容易受到热应激的影响[3]。此外,热应激还会降低精子的数量和活力[4],以及存活精子的受精能力[5]。
维甲酸(retinoic acid,RA)又称为视黄酸,是维生素A进入动物体内后的活性代谢物,其异构形式有 9-顺式维甲酸、13-顺式维甲酸和全反式维甲酸(all-transretinoic acid,ATRA),其中ATRA是睾丸发育过程中的重要启动物质[6],有抗炎[7]、抗氧化[8]、抑癌[9]和抗纤维化[10]等多重生物学功能。研究表明,ATRA在精原细胞分化、减数分裂起始,血睾屏障(blood-testis barrier,BTB)形成,精子发生和精子形成过程中发挥重要作用[11-14]。另外,ATRA能够重新调整精子代谢,使其接近获能状态,保护精子免受活性氧损伤,提高抗氧化酶活性[15]。然而,目前还没有关于维甲酸是否能干预环境高温影响睾丸功能的相关研究。
本试验以小鼠为研究对象,通过全身热暴露建立热应激模型,同时为小鼠灌胃维甲酸,旨在分析维甲酸是否能保护小鼠睾丸组织免受热应激带来的损伤,并探讨其可能的作用机制。
1.1 试验动物与材料
本试验得到南京农业大学动物伦理委员会批准(审核编号：NJAU.No20220517106)。所有试验程序均严格按照中华人民共和国科技部《实验动物管理和治疗规范》以及《实验动物管理和治疗条例》进行。
试验共选取40只体重相近的7周龄ICR雄性小鼠(购自南京卡莱斯生物科技有限公司),随机分为 4组,每组10只,分别为对照组(CON)、热应激组(HTRA0)、5 mg·kg-1维甲酸处理组(HTRA5)和10 mg·kg-1维甲酸处理组(HTRA10)。试验期间各组均饲喂基础饲粮,于清洁级动物房(温度25 ℃,相对湿度55%～60%)适应性饲养1周后开始正式试验。维甲酸处理组(HTRA5组和HTRA10组)热应激前分别灌胃ATRA(纯度≥99%,购自上海源叶有限公司,ATRA溶于少量二甲基亚矾并用玉米油稀释)5 mg·kg-1·d-1和 10 mg·kg-1·d-1,CON组和HTRA0组灌胃等体积玉米油(购自上海源叶有限公司,加入相应体积的二甲基亚矾),连续灌胃7 d。对照组置于25 ℃环境中,其余3组每天灌胃后,置于42 ℃环境中2 h给予全身热应激。在前期研究中对小鼠连续热暴露12 d(每天2 h),于第1、2、4、8、12天热暴露前后检测小鼠的直肠温度,均发现小鼠体温发生显著变化[16],且不同检测时间结果一致。说明热应激第7 天前后小鼠的体温可以代表小鼠体温的变化情况,同时为了减少多次直肠温度测定给小鼠带来的应激,因此本试验选择第 7天,即最后一次高温处理前后的温度作为小鼠体温变化的指标。
1.2 样品采集
研究表明,热应激对精子生成的影响会延续到热应激结束后的一段时间[16],其中热应激结束时是组织细胞中基因表达等各项指标变异的关键时间节点,一旦在这个时间点发生变化将会直接影响睾丸生精微环境,进而引起后续精子生成改变。因此,在本试验中,在第7天热应激结束后称重并处死小鼠,采集小鼠睾丸和附睾,并将左侧睾丸和附睾置于4%多聚甲醛中固定,右侧睾丸置于冻存管内,液氮迅速冷冻后置于-80 ℃低温冰柜储存备用,右侧附睾用于精子的采集。
1.3 测定指标与方法
1.3.1 睾丸指数、附睾指数和睾丸直径分离睾丸和附睾组织,剔除多余脂肪,称重。用游标卡尺测定 2个睾丸的长轴长度和短轴长度,2个长轴中较大者设为最大直径,2个短轴中较短者为最小直径。睾丸指数和附睾指数的计算公式如下：睾丸指数=睾丸重(g)/体重(g)×100%,附睾指数=附睾重(g)/体重(g)×100%。
1.3.2 精子活力在1.5 mL EP管中加入1 mL PBS预热,将分离出的一侧附睾在含有预热的PBS玻璃培养皿中除去多余的脂肪,剪去附睾头,将附睾尾置于EP管中,用眼科剪充分剪碎,于37 ℃、5% CO2条件下孵育30 min,使精子充分游出,获得精子悬液。将载玻片和盖玻片置于37 ℃载物台上预热,用微量移液枪取10 μL精子悬液,滴于载玻片上,加盖盖玻片,立即在显微镜下观察精子,利用计算机辅助精子分析(computer-aided sperm analysis,CASA)(NatureGene,美国)检测精子密度,并分析精子活力。
1.3.3 睾丸组织抗氧化性能称取60 mg左右睾丸组织,加入适量生理盐水制备组织匀浆,离心取上清液测定相关指标。丙二醛(MDA)含量采用TBA法测定,总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性采用羟胺法测定,过氧化氢酶(CAT)活性采用钼酸铵法测定,谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性采用比色法测定,总抗氧化能力(T-AOC)采用FRAP法测定,试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。
1.3.4 睾丸和附睾组织形态学观察取固定于多聚甲醛中的睾丸和附睾组织,经脱水、透明、透蜡等处理后进行包埋,切取5 μm厚度切片,进行HE染色,中性树脂封片后用显微镜观察并拍照,根据Shen等[17]方法使用ImageJ软件测定生精小管的横截面积、直径和上皮厚度。
1.3.5 附睾精子形态学观察和精子畸形率统计取1.3.2节中获得的精子悬液10 μL,在载玻片上涂片,自然风干,用甲醇固定10 min,干燥后用伊红染液染色30 s,用流水轻轻冲洗,风干后用中性树脂封片,显微镜下观察并拍照。畸形率的计算公式：精子畸形率=畸形精子数/精子总数×100%。
1.3.6 睾丸组织RNA提取和Real-time PCR采用Trizol试剂(诺唯赞生物科技有限公司)从睾丸组织匀浆中提取总RNA,使用分光光度法(NaoDrop 2000)测定RNA浓度及纯度,将RNA浓度调至500 ng·μL-1后使用试剂盒将RNA反转录为cDNA,采用荧光定量PCR试剂盒(北京擎科新叶生物技术股份有限公司)进行荧光定量PCR。引物序列见表1。
表1 RT-qPCR所用引物序列Table 1 Primer sequences used for RT-qPCR
1.4 数据处理与统计分析
试验数据使用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA),用Duncan’] s检验进行差异显著性分析。试验结果均以平均值±标准误表示。
2.1 热应激前后小鼠直肠温度变化
如表2所示,热应激前4个组小鼠直肠温度之间没有显著差异,热应激后3个热应激组的直肠温度与CON组相比均显著升高(P<0.05);除CON组外的3个组热应激后的直肠温度与处理前相比也都显著升高(P<0.05),说明本试验中热应激能使小鼠直肠温度显著升高。
表2 最后一次热应激前后小鼠直肠温度Table 2 Rectal temperature before and after the last heat stress
2.2 热应激前后睾丸重、睾丸指数和睾丸直径变化
如表3所示,HTRA0组小鼠的睾丸重与CON组相比显著降低(P<0.05),维甲酸处理后得到提高,其中HTRA10组与CON组相比无显著差异。睾丸指数与睾丸重也是相同的趋势,但是组间差异不显著。不同组之间睾丸最大直径没有显著差异,但与CON组相比,HTRA0组睾丸最小直径显著降低(P<0.05);与HTRA0组相比,HTRA10组小鼠睾丸最小直径增加,且与CON组相比没有显著差异。
表3 维甲酸对热应激小鼠睾丸重、指数和直径的影响Table 3 Effects of retinoic acid on testicular weight,index and diameter in heat-stressed mice
2.3 热应激前后睾丸组织形态变化
如图1所示,CON组小鼠睾丸组织生精小管形态正常,各级生精细胞排列整齐,管腔内可见成熟精子。HTRA0组小鼠睾丸生精小管各级生精细胞数量减少,排列紊乱,管腔变大,管腔内成熟精子数量明显减少。维甲酸处理组有所改善,形态更接近CON组小鼠。
图1 维甲酸对热应激小鼠睾丸组织形态的影响Fig.1 Effect of retinoic acid on testicular morphology in heat-stressed mice A. 小鼠睾丸组织HE染色(红色箭头指示睾丸间质细胞,蓝色箭头指示生精小管管腔,黄色线段指示生精上皮);B、C、D. 生精小管横截面积、直径和上皮厚度。A. HE stained of mouse testicular tissue(red arrows indicate testicular interstitial cells,blue arrows indicate the lumen of spermatogenic tubules,and yellow lines indicate spermatogenic epithelium);B,C,D. Cross setional area,diameter,and height of mouse seminiferous tubule.
对睾丸组织变化进一步量化发现,与CON组相比,HTRA0组小鼠睾丸生精小管的横截面积、直径和生精小管上皮厚度都显著降低(P<0.05);与HTRA0组相比,HTRA5组和HTRA10组小鼠睾丸生精小管横截面积、直径和生精小管上皮厚度显著增加(P<0.05),更接近CON组,其中生精小管直径和CON组相比无显著差异。
2.4 热应激前后附睾组织形态、附睾精子密度和畸形率变化
由图2可知,与CON组相比,HTRA5组和HTRA10组小鼠附睾重显著降低(P<0.05),但是不同组之间附睾指数无显著差异。CON组小鼠附睾管腔内可见大量成熟精子,HTRA0组管腔内精子减少,维甲酸处理后有所改善,更接近CON组。对附睾精子密度统计发现,维甲酸和热应激对小鼠附睾精子密度没有产生显著影响,但与CON组相比,HTRA0组密度略低,维甲酸处理后有升高的趋势。对小鼠附睾精子进一步分析发现,与CON组相比,HTRA0组小鼠附睾精子畸形率显著升高(P<0.05);与HTRA0组相比,HTRA5组和HTRA10组小鼠附睾精子畸形率显著降低(P<0.05)。
图2 维甲酸对热应激小鼠附睾、附睾精子密度和畸形率的影响Fig.2 Effects of retinoic acid on epididymal,epididymal sperm density and malformation rate in heat-stressed mice A.小鼠附睾组织HE染色(黑色箭头指示附睾管腔内的精子);B. 附睾精子伊红染色(红色箭头指示精子头部,蓝色箭头指示精子尾部,方框表示局部放大);C—F. 附睾重、附睾指数、精子密度和精子畸形率。A. HE stained of mouse epididymal tissue(black arrows indicate sperm in the epididymal lumen);B. Eosin stained of mouse epididymal sperm(red arrows indicate the head of the sperm,blue arrows indicate the tail of the sperm,box represents local magnification);C-F. Weight,index of epididymis,density and malformation rate of sperm.
2.5 热应激前后附睾精子活力变化
如图3所示,与CON组相比,HTRA0组小鼠精子的总活力显著降低(P<0.05),前进运动、快速运动精子比例显著下降(P<0.05),不运动比例显著增加(P<0.05)。维甲酸处理后得到改善,其中HTRA10组小鼠精子的总活力、前进运动、快速运动及不运动精子的比例与CON组相比都没有显著差异。
图3 维甲酸对热应激小鼠附睾精子活力的影响Fig.3 Effect of retinoic acid on epididymal sperm motility in heat-stressed mice
2.6 热应激前后睾丸抗氧化性能变化
如表4所示,与CON组相比,HTRA0组小鼠睾丸MDA含量显著升高(P<0.05),T-SOD活性显著降低(P<0.05);与HTRA0组小鼠相比,HTRA5组和HTRA10组小鼠睾丸MDA含量显著降低(P<0.05),T-SOD活性显著升高(P<0.05),与CON相比无显著差异。不同组间T-AOC和CAT活性、GSH-PX活性无显著差异。
表4 维甲酸对热应激小鼠睾丸抗氧化性能指标的影响Table 4 Effect of retinoic acid on the antioxidant activity in the testes of heat-stressed mice
2.7 热应激前后睾丸抗氧化相关基因表达差异
如图4所示,与CON组相比,HTRA0组小鼠睾丸nrf2、ho-1、nqo1、sod1和gpx1 mRNA相对表达量都显著升高(P<0.05)。与HTRA0组相比,HTRA5组和HTRA10组小鼠睾丸nrf2、ho-1、gclc、sod1和gpx1表达量均无显著差异,但HTRA10组小鼠睾丸ho-1、gclc和sod1表达量有降低趋势,且gclc和sod1与CON组相比均无显著差异。HTRA10组小鼠睾丸nqo1基因表达量显著低于HTRA0组(P<0.05),且与CON组无显著差异。
图4 维甲酸对热应激小鼠睾丸抗氧化 相关基因表达的影响Fig.4 Effect of retinoic acid on the expression of antioxidant-related genes in the testes of heat-stressed mice
2.8 热应激前后睾丸增殖和凋亡相关基因表达差异
如图5所示,与CON组相比,HTRA0组bax基因相对表达量显著升高(P<0.05),bcl-2表达量升高,但差异不显著;与HTRA0组相比,HTRA10组bax基因相对表达量显著降低(P<0.05),与CON组差异不显著,HTRA10组bcl-2与HTRA0组相比显著降低(P<0.05)且与CON组差异不显著。不同组别之间bax与bcl-2基因表达量比值差异不显著。
图5 维甲酸对热应激小鼠睾丸增殖凋亡 相关基因表达的影响Fig.5 Effect of retinoic acid on the expression of genes related to proliferation and apoptosis in the testes of heat-stressed mice
2.9 热应激前后睾丸血睾屏障相关基因表达差异
如图6所示,与CON组相比,HTRA0组小鼠睾丸occludin、zo-1、n-cadherin和connexin43 mRNA表达量显著升高(P<0.05)。与HTRA0组相比,HTRA5组小鼠睾丸occludin、zo-1、n-cadherin和connexin43 mRNA表达量无显著差异,HTRA10组小鼠睾丸zo-1、n-cadherinmRNA表达量显著降低(P<0.05)。HTRA10组小鼠睾丸zo-1、n-cadherin和connexin43 mRNA表达量与CON组相比无显著差异。
图6 维甲酸对热应激小鼠睾丸血睾屏障 相关基因表达的影响Fig.6 Effect of retinoic acid on the expression of genes related to the blood-testis barrier in the testes of heat-stressed mice
2.10 热应激前后睾丸精子发生相关基因表达差异
如图7所示,与CON组相比,HTRA0组小鼠睾丸plzf和c-kitmRNA表达量都显著升高(P<0.05)。与HTRA0组相比,HTRA5组和HTRA10组小鼠睾丸plzf和c-kitmRNA表达量显著降低(P<0.05),且c-kit与对照组相比无显著差异。不同组间stra8和sycp3基因的表达量无显著差异。
图7 维甲酸对热应激小鼠睾丸精子发生 相关基因表达的影响Fig.7 Effect of retinoic acid on the expression of genes related to spermatogenesis in the testes of heat-stressed mice
3.1 维甲酸对热应激小鼠睾丸重、直径及组织形态的影响
当动物所处的温度超过其生理范围和调节能力时,就会发生热应激;尽管热应激通常会影响机体的各种功能,但生殖是最容易受到热应激损害的过程[16]。Lin等[18]研究表明,将雄性小鼠身体的后三分之一给予43 ℃水浴热处理15 min后,小鼠睾丸指数显著降低,生精小管损伤严重,变性、空泡化严重,管腔变大,生精细胞脱落萎缩,睾丸形态异常。刘慧娟等[19]给予小鼠全身热应激后,小鼠睾丸生精小管的横截面积和生精小管直径显著降低。本试验结果也表明热应激使小鼠睾丸组织受到损伤。Zhou等[20]试验中腹腔注射维甲酸能显著提高隐睾小鼠的睾丸重和睾丸体积,改善隐睾小鼠睾丸组织形态,提高小鼠附睾精子密度、降低精子畸形率。本试验结果提示维甲酸能改善热应激小鼠睾丸形态,这可能与维甲酸能缓解氧化应激,改善生精微环境有关[15,18,21]。
3.2 维甲酸对热应激小鼠附睾和附睾精子的影响
生精细胞对温度变化极为敏感,对温度有严格的要求,其中睾丸温度调节发挥着非常重要的作用。尽管是在小范围内的阴囊温度升高,也可能会对精子质量产生负面影响[22]。Yaeram等[5]试验结果表明,将雄性小鼠连续2 d全身暴露在36 ℃的温度下12 h后,精子数量减少,睾丸重降低,精子在体内的受精能力较差,附睾精子与透明带的结合能力和卵细胞穿透能力降低。在另一项研究中,将小鼠连续3 d全身暴露于高温8 h后其附睾尾部精子数量无显著变化,但活力较低,此外这些附睾精子还表现出膜性变化,使其更容易发生凋亡[23]。与之相似,本试验发现,连续7 d给予小鼠全身42 ℃热处理2 h后精子密度没有显著变化,但是精子活力显著下降,运动性能显著降低。彭金普[24]通过给隐睾大鼠注射维甲酸发现,维甲酸显著提高了隐睾大鼠的附睾精子数量,降低附睾精子畸形率,提高隐睾大鼠的生殖功能,可能是因为维甲酸与精子的形成与释放有关。本试验结果也表明维甲酸可改善热应激小鼠精子活力。
3.3 维甲酸对热应激小鼠睾丸抗氧化功能的影响
一般来说,热应激导致的生精细胞凋亡和精子活力下降是由氧化应激和细胞凋亡引起的[25-26]。Lin等[18]研究结果表明,给予小鼠睾丸43 ℃热应激15 min后,睾丸MDA含量显著升高,睾丸中SOD活性显著降低。本研究结果与之一致,表明热应激组小鼠睾丸组织的抗氧化系统已经受到损害。睾丸组织中过多的氧自由基导致了睾丸生精细胞的发育改变和精子生长迟缓。维甲酸具有很强的抗氧化活性和抗氧化作用[15,27]。本试验中两种剂量的维甲酸都能显著提高小鼠睾丸组织的SOD活性,降低热应激所造成的MDA水平升高。这表明维甲酸能有效地清除氧自由基,抑制脂质过氧化反应,减轻热处理对生精细胞的损伤。且在2个剂量的处理中,10 mg·kg-1的处理效果更好。
Nrf2作为主要的内源性抗氧化防御系统,在防止睾丸氧化损伤方面起着至关重要的作用。在亲电或氧化应激时,Nrf2被激活并转录诱导一系列抗氧化防御酶,例如CAT、NQO1、HO-1和谷胱甘肽S-转移酶等[28]。这些依赖Nrf2的抗氧化剂的上调能促进机体的抗氧化、解毒和抗炎反应。本研究结果表明热应激激活了小鼠睾丸组织的Nrf2通路,启动下游基因的转录,增加睾丸抗氧化能力,减少氧化损伤。与Li等[16]研究中给予小鼠全身热应激(42 ℃,2 h,12 d)后小鼠睾丸nrf2、gclc、ho-1和nqo1 mRNA表达上调结果一致。灌胃维甲酸后,这些基因表达下调,更接近对照组水平,推测维甲酸能够缓解睾丸组织的氧化应激水平,增强睾丸组织的抗氧化能力,保护睾丸组织免受热应激带来的氧化应激损伤。
3.4 维甲酸对热应激小鼠睾丸增殖凋亡基因表达的影响
细胞凋亡的过程需要许多不同的细胞蛋白,例如Bcl-2家族成员。Bcl-2蛋白家族包含促凋亡Bax和抗凋亡Bcl-2成员。Xi等[29]结果表明,给予成年公猪局部睾丸加热(42 ℃,1 h)后bax和bcl-2的mRNA和蛋白水平升高,导致生精细胞凋亡增加。与之相似,本试验中给予小鼠全身热处理7 d后小鼠睾丸组织中bax基因表达量显著升高,灌胃10 mg·kg-1维甲酸能显著降低热应激小鼠bax和bcl-2 mRNA表达量,说明维甲酸对热应激导致的小鼠睾丸组织细胞凋亡有改善作用。
3.5 维甲酸对热应激小鼠睾丸血睾屏障基因表达的影响
由几种类型的细胞连接形成的BTB可以维持精子生成[30]。BTB通过在生精小管的支持细胞之间形成选择性屏障,将睾丸与循环系统隔离,并维持适宜的生精微环境,能够使精子持续产生[31]。维持紧密连接功能所必需的蛋白质包括Occludin、Zonula occludens(ZO-1)和N-cadherin。Connexin 43是一种缝隙连接标志物,是正常睾丸发育和精子形成所必需的,并具有调节BTB形成的功能。胡素琴等[32]研究表明,给予大鼠43 ℃恒温水浴20 min后,大鼠睾丸中ZO-1、Occludin蛋白表达显著降低,睾丸屏障受损。因此在本研究中对编码这些关键蛋白质的基因表达进行了评估。本试验结果显示,热处理后小鼠睾丸组织中occludin、zo-1、n-cadherin和connexin43 mRNA的表达量显著升高。这种结果产生的原因可能是长时间的热处理导致血睾屏障受到损伤,所以需要更多地表达来对这种损伤进行紧急补救。而添加维甲酸后这些基因表达量较热应激组相比降低,其中10 mg·kg-1维甲酸组显著降低且与对照组相比没有显著差异,提示维甲酸可能通过维持紧密连接和缝隙连接蛋白的功能来调节BTB的完整性,改善生精微环境,进而改善精子活力。
3.6 维甲酸对热应激小鼠睾丸精子发生基因表达的影响
精子发生是一个复杂的动态变化过程,包括精原细胞增殖分化、减数分裂和精子形成三个阶段。在这个过程中,不同时间段受到不同因子的调控[4]。其中C-kit、PLZF对生精细胞的增殖分化不可或缺,Stra8、Sycp3与减数分裂密切相关,是减数分裂标志。C-kit表达于分化的精原细胞,可以作为精原细胞分化的标志物,表明了精原细胞分化程度[33];PLZF作为一种精原细胞特异性转录因子,可能在调节干细胞的自我更新和维持分化过程中发挥核心作用[34],是精原细胞和精母细胞增殖相关的重要生物标志物。彭金普[24]研究表明,维甲酸能上调隐睾大鼠生精细胞增殖分化及减数分裂相关蛋白和基因的表达,提示维甲酸能促进隐睾大鼠的生精细胞增殖分化和减数分裂。在本试验中,热应激后小鼠睾丸内c-kitmRNA表达上调,而维甲酸处理后其表达下调接近对照组小鼠睾丸,可能是热应激导致精母细胞分化受阻,而维甲酸维持了精原细胞分化。热应激组小鼠睾丸plzf基因表达水平的增加也表明热应激组小鼠睾丸精原细胞和精母细胞的增殖出现异常,维甲酸处理后表达下调,说明维甲酸可能对热应激小鼠精原细胞的分化和增殖产生积极影响,以维持正常精子发生过程。
综上所述,本试验采用小鼠全身热应激模型测定了维甲酸对热应激小鼠睾丸组织损伤的影响,结果表明：维甲酸能够改善热应激小鼠的睾丸重、睾丸组织形态和附睾精子活力,使之更接近对照组水平;这种保护作用可能是通过增加小鼠睾丸抗氧化能力,减少生精细胞凋亡,增强血睾屏障,改善生精微环境,维持精子发生实现的。在本试验中,10 mg·kg-1的维甲酸处理效果更好。
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