张永红，李岩异 ，刘容麟，吕娜，张卫婷
华北制药金坦生物技术股份有限公司，石家庄 050035
免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）是存在于哺乳动物血液、组织液等中的一类蛋白质，当机体免疫系统受到抗原的刺激诱导而产生，能与相应的抗原发生特异性结合，达到中和抗原的作用，以抵抗病毒、过敏原、细菌和毒素等物质的侵袭。由于免疫球蛋白的生物学活性，其广泛应用于生化诊断、生物制药和免疫治疗等方面［1］，免疫球蛋白Y存在于许多物种体内，从低等的两栖类、爬行类到高等动物鸟类［2］，它与哺乳动物中的免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）具有相同的生物学活性［3］。然而，IgY 不能结合或激活哺乳动物补体系统、Fc受体和类风湿因子［4］。
随着新型冠状病毒的全球大流行，各种病毒的防控研究迫在眉睫。目前针对病毒感染最好的防控手段仍然是被动免疫。被动免疫是将特异性的免疫球蛋白或者抗体直接输入未经免疫的受试者体内，从而获得免疫力。各种病毒疫苗能有效地预防病毒感染，降低疾病的发生率和死亡率，但疫苗的开发耗时长且成本高昂，同时还需面临很多挑战，例如如何应对毒株的变异和抗原的突变等。
在病毒学研究领域，IgY 主要应用于病毒性疾病的诊断和治疗。IgY 的产生一般只需要2 个月时间，接种母鸡可以生产含有保护性IgY 抗体的鸡蛋［5］，这些抗体可以很容易地加工成持久且易于储存的冻干产品。在抗病毒方面，通过IgY被动免疫，能够为人类和动物提供快速和及时的保护，抵抗病毒感染［6］。因此，在一些突发情况下，免疫球蛋白治疗策略能够为免疫人群或动物在窗口期提供一种安全、紧急的治疗方案［7］。近期关于IgY 的综述主要集中在其生产工艺、疾病诊断方面，对于病毒性疾病的治疗少有报道，本综述通过对IgY 特性的最新研究、生产技术的进展进行报道，重点介绍了IgY 在病毒性疾病治疗方面的应用，以期为IgY 在病毒感染性疾病治疗领域的应用提供一些启示。
IgY 和IgG 均具有典型的免疫球蛋白的空间构象（图1），两者由两条相同的重链和轻链组成，通过二硫键结合在一起。它们具有可变区和恒定区，其中可变区识别并结合抗原，恒定区提供效应功能。它们通过与抗原特异性地结合，达到中和抗原的作用，以抵抗病毒、过敏原细菌和毒素等物质［8］。
图1 IgY和IgG的结构图Figure 1 The structural diagram of IgY and IgG
IgY 和IgG 虽然存在功能同源性，但在分子量、结构和生化功能上存在显著差异。IgY 分子量更高，约为180 kD（重链65 kD，轻链25 kD）［9］；
IgY 的重链由4 个恒定区和1 个可变区组成；
IgY没有铰链区，而IgG 有一个铰链结构；
IgY 的疏水基团多于IgG，这使得它更适于脂类含量丰富的卵黄环境。IgY 这种特殊结构致使摆动性、柔韧性下降；
与IgG 相比，IgY 稳定性较好，具有更强的抗蛋白酶水解功能［10］。
最初的IgY 生产工艺是给肉鸡接种目标抗原，诱导体液免疫，其血清能够产生特异性的免疫球蛋白，同时作为一种防御措施，免疫球蛋白能够从血清中转移到蛋黄中从而被动保护发育的雏鸡［11］。一般IgY 产生的量占鸡总抗体的1%～10%，每个蛋黄大约能提供100 mg 的IgY 产量。抗体滴度受多种因素的影响，如抗原类型和剂量、佐剂的使用、接种途径、接种频率、鸟类的发育阶段等［10］。所需的接种次数取决于抗原的类型和剂量，以及所使用的佐剂。产蛋期前必须进行至少两次接种，间隔时间为4～6周。
佐剂具有增强作用［12］，可诱导产生高滴度的抗体。弗氏完全佐剂（Freund"s adjuvant complete，FCA）和非弗氏完全佐剂（Freund"s adjuvant incomplete，FIA）是IgY 生产中常用的佐剂［13］。虽然佐剂在注射部位能诱导炎症反应，但研究结果显示鸟类比哺乳动物更耐受FCA［14］。CPG寡脱氧核苷酸（CPG oligonucleotide，CPG-ODN）作为一种新型的佐剂能够减少动物的疼痛并显著提高IgY的产量［15］。现在主要的接种途径是鸡胸部肌肉注射，与鸡腿部或脖子部位注射相比，这种注射方式损害较小，并且能产生与皮下免疫相当的抗体量［16］。此外，抗原也可以通过口服给药［17］。
目前，有一些规模化、成熟的方法能够从鸡蛋黄中有效提取IgY 活性成分。主要方法是蛋黄中去除脂蛋白后，形成水溶性的中间体，后续进行抗体的沉淀和提纯。IgY 纯化方法有聚乙二醇沉淀法、硫酸铵沉淀法、超过滤法、凝胶过滤法、亲硫凝胶色谱法和离子交换层析法等。目前，提取IgY 的方法较为常用的是聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）6000 沉淀法。提取方法会影响产率和最终纯度，选择何种提取方法取决于研究目的、纯化程度、提取规模、成本以及环境条件［17］。
3.1 流感病毒
流感是一种由流感病毒家族（通常分为甲、乙、丙三型）［18］引起的具有高度传染性的呼吸道疾病。虽然流感通常是一种自限性疾病，但是也会出现肺炎和器官衰竭等可导致死亡的并发症，尤其对于易感人群。流感病毒几乎每年都会因抗原漂移而出现新的变异病毒株，尽管研究者针对新的毒株，一直在努力开发新型有效的流感病毒疫苗，但疫苗也只能将流感疾病的发生率降低约50%［19-20］。由于疫苗接种和抗病毒药物的局限性，抗流感IgY 可能是一种低成本和快速的预防方法。Nguyen 等［21］发现鼻内给予50 μL 抗流感H5N1（hemagglutinin 5，neuraminidase 1）IgY，通过与病毒表位结合，能够阻止流感病毒进入小鼠体内，预防其感染H5N1病毒。
针对各种流感病毒株开发的IgY 是一种有效的流感治疗方法。Wallach 等［22］生产了针对H1N1（hemagglutinin 1，neuraminidase 1）、H3N2（hemagglutinin 3，neuraminidase 2）和H5N1 流感病毒株的IgY，体外血清中和实验和血凝抑制试验证实IgY 抗体具有抑制同源毒株的作用（表1）。体外实验发现，针对乙型流感病毒（influenza B viruses，IBV）的IgY同样具有抑制血凝素和神经氨酸酶的活性，并能够抑制病毒的复制。当鼻内给予小鼠抗IBV IgY 时，可预防乙型流感的发生和减缓轻型疾病的进展［23］。
表1 IgY抗体在部分病毒感染性疾病中的作用Table 1 The role of IgY antibody in some viral infectious diseases
3.2 轮状病毒
轮状病毒是儿童腹泻的最常见原因，目前临床上尚无治疗轮状病毒感染的有效药物，一般处理方法是补充水和电解质。Rahman 等［24］进行了一项随机安慰剂对照试验，以评估IgY对轮状病毒的疗效。在这项试验中，52名轮状病毒患儿每天4次，每次1袋口服卵黄蛋白混合物，该混合物是通过用两种轮状病毒株免疫母鸡获得的。研究人员发现，这种治疗方法减少了口服补液的用量，缩短了病程，并且特异性IgY能够以剂量依赖的方式抑制细胞损伤和轮状病毒的粘附［25］。此外，还有一项随机安慰剂对照试验，参与对象为轮状病毒肠炎患儿，每天3 次口服1.0 g 抗轮状病毒鸡卵黄免疫球蛋白，比较IgY与益生菌的治疗效果。结果显示，IgY 比益生菌能更有效地缩短病程，并显著降低腹泻的频率［26］。Wang 等［27］对17 项随机临床试验中2 626 名轮状病毒腹泻婴儿进行了分析。其中，1 347 名口服抗轮状病毒IgY 进行治疗，1 279名接受常规治疗，结果表明，抗轮状病毒IgY 明显比常规治疗更有效。以上结果表明IgY 能更有效地治疗轮状病毒肠炎。
3.3 寨卡病毒
寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）主要由伊蚊传播，是西半球新出现的一种病原体。目前，还没有针对寨卡病毒感染的有效药物或疫苗。已有研究发现，ZIKV IgY 在斑块减少中和试验中，产生的保护作用大于50%，并且ZIKV IgY 在体外不产生抗体依赖的增强作用（antibody-dependent enhancement，ADE）［28］。腹腔注射1 mg ZIKV 特异性IgY，可以保护小鼠3 周内免受致命的ZIKV 攻击（表1）。该研究证明了鹅源性抗ZIKV IgY 在体外和体内的有效性，且研究提出多克隆ZIKV特异性IgY 可能为寨卡病毒感染提供了一种可行的无ADE的被动免疫方法。
3.4 肝炎病毒
乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）和丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是引发大多数肝炎甚至死亡的原因［34］。但就乙型肝炎而言，虽然有预防的疫苗，但还没有有效的治疗方法，而对于丙型肝炎则尚无可用疫苗［35］。因此，开发治疗和预防的药物仍是当务之急。Guo 等［36］曾尝试用禽戊型肝炎病毒重组抗原表位免疫禽类，制备出抗戊型肝炎病毒IgY，但所制备的抗体在体外不具有抗感染的保护作用和中和作用。在病毒性肝炎领域，利用IgY 治疗肝炎仍是一个有待探索的目标。尽管接种疫苗有效，但人类的疫苗接种率很低，在资源有限的情况下可能无法获得正规的免疫疗法，IgY 作为治疗人类感染HBV 的方法也可能值得评估（表1）。
与人类HBV 相似，鸭乙肝病毒感染可导致慢性肝炎、纤维化、肝硬化和肝细胞癌［37］。在接种鸭乙肝病毒疫苗的鸭产的蛋黄中发现了特异性的高滴度IgY［38］。
3.5 埃博拉病毒
埃博拉病毒（Ebola virus，EBoV）感染较为罕见，但在人类和非人类灵长类动物中可导致高死亡率。目前，对抗EBoV 主要有恢复期血浆、单克隆抗体等方法。虽然EBoV 治疗性抗体具有良好的应用前景，但局限性仍然十分突出。首先，恢复期血浆的来源和安全性有限，阻碍了其应用。其次，单克隆抗体具有制备周期长、生产成本高、运输和储存条件严格等劣势。此外，埃博拉疫情主要发生在温带和较贫困的非洲地区，这也限制了治疗性抗体的应用。
已有研究发现用编码EBoV 的糖蛋白对母鸡进行免疫，并可以诱导母鸡产生高滴度的IgY 抗体。小鼠腹腔注射高剂量IgY（106NAU·kg-1）可达到完全的保护作用，而注射低剂量IgY（104NAU·kg-1）的小鼠则表现出部分的保护作用（表1）［29］。低成本及大规模生产和避免抗体依赖性增强的优势可能使抗埃博拉病毒IgY 成为一种新颖的药物。
3.6 中东呼吸综合征冠状病毒
中东呼吸综合征冠状病毒（Middle East respiratory syndrome，MERS-CoV）是一种不断进化的人畜共患病毒，可引起人类致命的呼吸道疾病［39-40］，于2012 年首次被发现［41］。虽然大多数病例是在中东报告的，但该病毒有可能引起全球大流行。目前还没有获批的治疗方法或疫苗［42］。
已有研究利用体外中和实验评估了MERSCoV 刺突蛋白特异性的IgY 对MERS-CoV 感染的中和效果。给鸡注射纯化的MERS-CoV 重组S1蛋白，在免疫后第7 周，可产生特异性IgY。免疫印迹实验表明，IgY 抗体能特异性结合MERSCoV S1 蛋白。免疫荧光实验证实，抗S1 IgY 抗体也能识别细胞内的MERS-CoV。斑块减少和微量中和试验显示，抗S1 IgY 抗体在感染MERS-CoV的小鼠Vero 细胞中能有效中和MERS-CoV，肺组织中病毒抗原表达量明显减少，炎症反应明显减轻（表1）［30］。数据表明，抗MERS-CoV S1 IgY可以作为MERS-CoV感染的潜在候选药物。
3.7 其他病毒
3.7.1 汉坦病毒 汉坦病毒肺综合征（Hantavirus pulmonary syndrome，HPS）是一种主要由安第斯病毒（Andes virus，ANDV）感染引起的罕见、严重和潜在致命的呼吸道疾病［43］，目前还没有有效的治疗方法［44］。Brocato 等［31］研究发现IgY 抗体在体外具有中和ANDV 的能力。鼻内给予ANDV 攻击叙利亚仓鼠8 d后，给予≥5 000 NAU·kg-1抗ANDV的IgY，体外斑块减少中和实验检测发现，IgY抗体能有效地中和ANDV；
给予12 000 NAU·kg-1鸭蛋来源的IgY/IgY△Fc 可保护仓鼠免受ANDV 的攻击（表1）。这表明IgY作为ANDV感染后预防HPS发病的治疗方法值得评估。
3.7.2 肠道病毒71(enterovirus 71,EV71) EV71病毒感染通常是轻微的，如手足口病和疱疹性咽峡炎，但偶尔会导致严重的疾病，如无菌性脑膜炎、脊髓灰质炎样麻痹，甚至对新生儿致命的脑炎［45］。目前尚无治疗人类EV71 型病毒感染的常规疗法。研究人员评价了卵黄免疫球蛋白（IgY）对人肠病毒71 型（EV71）的被动保护作用。以灭活的人EV71 病毒为抗原免疫母鸡，纯化蛋黄中的IgY。结果表明，从第一次免疫后第3 周开始，IgY 特异性抗体滴度升高；
免疫后3～18周，卵黄总IgY 含量为每蛋黄190±26 mg，特异IgY 平均浓度为每蛋黄6.34±3.38 mg（表1）［32］。EV71 攻毒小鼠实验结果表明，无论是腹腔注射还是口服给药，EV71 特异性IgY 都能显著降低EV71 感染幼鼠的发病率和死亡率。
3.7.3 牛呼吸道合胞病毒 牛呼吸道合胞病毒（bovine respiratory syncytial virus，BRSV）和人类呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus，HRSV）是两种密切相关的病毒，分别是犊牛［46］和幼儿严重呼吸综合征的主要病因。两种病毒感染的流行病学和发病机制非常相似［47］。为了预防该疾病，被动免疫可以成为传统疫苗接种的一种实用替代方案。Ferella 等［33］对鸡卵黄IgY 的产生及其体外中和BRSV 的能力进行了评价（表1）。纯化的抗BRSV IgY 特异性识别BRSV 并能中和该病毒，说明IgY 可以作为治疗RSV 感染的潜在药物。
通过采用单克隆抗体或恢复期血浆中的抗体可以有效地治疗各种传染病，但抗体的应用局限性仍然十分突出。例如，恢复期血浆来源的有限性和单克隆抗体生产的高成本等缺点，均阻碍了抗体在病毒性疾病治疗方面的应用。特异性抗病毒药物和疫苗的研发周期长、生产工艺复杂、成本高，因此有必要探索开发一种针对病毒感染性疾病更为快捷、经济、有效的替代疗法。IgY 具有中和体内病原体的能力，同时具有易生产、成本低、起效快等优点。IgY 抗体口服或鼻内给药，对可能定植、感染或损害胃肠道和呼吸道的病原体，发挥广泛的中和能力，达到优良的治疗效果。虽然在病原体感染前服用IgY，已被证实具有显著的保护作用，但针对血液循环中或定位于特定区域的特定病原体，IgY 抗体的中和作用可能还需要进一步评估。通过与生物工程技术的结合（如基因重组技术、噬菌体展示技术），IgY 抗体可以实现大规模生产。随着对IgY 技术研究和应用的不断深入，IgY 的前景会越来越广阔。未来IgY 有望成为一类新型药物，为人类疾病的治疗和预防带来全新的视角和希望。
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