王衍彬，陈雅丹，秦玉川，吴晓红，黄旭波，程俊文，王丽玲，方茹，贺亮
（1. 浙江省林业科学研究院，浙江 杭州 310023；
2. 浙江东方梅园有限公司，浙江 湖州 313199 )
绿萼梅Prunusmumef.viridicalyx为蔷薇科Rosaceae 李属Prunus落叶小乔木，因其萼绿花白而得名。绿萼梅天然分布于我国浙江、江苏、安徽、湖北等地[1]，是一种应用广泛的园林观赏和药用植物。绿萼梅的花香气浓郁，既可作为芳香原料，亦是一种传统中药，被收录在《本草纲目》《本草拾遗》等古代经典药籍中，具有疏肝和中、理气化痰之功效，常被用于治疗头晕、肝胃气痛以及食欲不振等病症[2]；
亦被收录在《中国药典》中，近年来研究发现，其花蕾中含有丰富的挥发油类、黄酮类、苷类、苯丙素类等活性成分[3-7]，其中以绿原酸为代表的苯丙素类和以芦丁和金丝桃苷为代表的黄酮类成分含量最高[4-5]，并发现其具有防止黑色素沉积、抗抑郁、清除体内自由基、抑制醛糖还原酶和抗血小板凝集等[2,5,8-10]功能，具有较好的应用潜力。
近年来，国内外学者针对绿萼梅的研究，主要集中在中药质量控制和药用成分分析方面，对其挥发性成分的研究尚未见报道，文献仅有少量有关蜡梅Chimonanthuspraecox、杏梅P.mumevar.bungo、山桃P.davidiana等相近植物花挥发性成分的研究[11-16]，但其挥发性成分的组成均与绿萼梅挥发性成分相去甚远。绿萼梅花质轻、气香、味淡、微涩，是一种优质的芳香原料，具有极大的芳香产品开发潜力。目前，植物挥发性成分提取方法研究众多，水蒸气蒸馏法（Steam distillation，SD）、同时蒸馏萃取法（Simultaneous distillation extraction，SDE）、减压蒸馏法（Vacuum distillation extraction，VDE）、顶空吸附法（Headspace adsorption，HAS）、顶空-固相微萃取法（Headspace-Solid Phase Microextraction，HS-SPME）、超声波萃取法（Ultrasonic extraction，UE）、超临界CO2萃取法（Supercritical CO2extraction，SFE）等方法均有应用，但各有优缺点。不同萃取方法对获得的挥发性成分物质种类和相对含量有差异[17-18]，绿萼梅中的挥发性成分较为复杂，各种提取方法的原理不同，所得到的挥发性物质是否一致，差异是否显著，目前尚无报道。
本研究采用SD、HS-SPME 和SFE 三种常用萃取方法提取绿萼梅挥发性成分，并结合气相色谱-质谱联用技术对其提取物的组分进行对比分析，旨在全面了解绿萼梅的挥发性成分组成，探讨研究能较完整保留绿萼梅挥发性成分的提取方法，为绿萼梅的产业化开发提供数据支撑。
1.1 主要材料与试剂
绿萼梅花蕾，2023 年3 月13 日采自浙江省长兴县东方梅园有限公司梅花基地，每50 g 新鲜样品放置于1个PE 袋中，每袋放干燥剂10 g，运回实验室后立即进行处理；
二氯甲烷，色谱纯，美国Tedia 公司；
无水硫酸钠，分析纯，成都科隆公司；
二氧化碳，纯度99.9%，杭州悦通气体有限公司。
1.2 主要仪器与设备
固相微萃取装置，100 μmDVB/CAR/PDMS 萃取头，Supelco 公司；
Spe-2 超临界CO2萃取仪，美国AppliedSeparations(ASI)公司；
低温恒温槽，南京新晨生物科技有限公司；
7890A-5975C 气相色谱-质谱联用仪，美国安捷伦科技有限公司；
AL204-1C 型电子分析天平，感量：0.001 g，瑞士Mettler Toledo 公司；
TC-15 套式恒温器，海宁市新华医疗器械厂；
DW-2030 低温冷却液循环泵，杭州大卫科教仪器有限公司。
1.3 研究方法
1.3.1 顶空-固相微萃取法（HS-SPME） 称取15.000 g 绿萼梅花蕾加到50 mL 萃取瓶中，将萃取瓶放入金属浴加热槽中，设置加热温度为80 ℃，吸附时间为60 min。萃取完成后，将萃取头插入气相色谱进样口，进行GC-MS 分析。
1.3.2 水蒸气蒸馏法（SD） 称取15.000 g 绿萼梅花蕾放入500 mL 圆底烧瓶中，加入蒸馏水至烧瓶2/3 处，放入套式恒温器加热3 h，设置加热温度为102 ℃，冷凝回收挥发油。吸取收集到的挥发油50 μL，溶于2 mL正己烷中，加入0.200 g 无水硫酸钠脱水，过0.45 μm 有机滤膜，进行GC-MS 分析。
1.3.3 超临界CO2萃取法（SPE） 称取15.000 g 绿萼梅花蕾加入到50 mL 超临界二氧化碳萃取釜中，设置萃取温度为40 ℃，萃取压力为30 MPa，萃取时间为2 h，收集萃取产物，称取50 mg 样品，溶于2 mL 二氯甲烷中，加入0.200 g 无水硫酸钠脱水，过0.45 μm 有机滤膜，进行GC-MS 分析。
1.3.4 GC-MS 分析条件 色谱柱Agilent J&W DB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm），进样口温度250 ℃；
升温程序：初始温度50 ℃，保持1 min，以8 ℃·min-1升至160 ℃，保持1 min，再以5 ℃·min-1升至300 ℃，保持20 min；
载气为高纯氦气，流速：1.0 mL·min-1，不分流进样；
液体样品进样量1.0 μL，固相微萃取解析时间2 min。电子轰击（EI）离子源，离子源温度230 ℃，传输线温度280 ℃，激活电压1.5 V；
质量扫描范围m/z 35 ～ 600。
1.4 数据处理
数据整理、平均值和标准差计算等采用WPS 2019，主成分分析和绘图采用Origin Pro2023。
2.1 绿萼梅挥发性成分比较分析
用SD、HS-SPME 和SFE 三种方法萃取绿萼梅花蕾中的挥发性成分，得到总离子流图如图1。经NIST 谱库对比、鉴定（相似的≥85%）所获得化学成分，并对其采用面积归一化法计算各成分的相对含量，结果见表1。综合比较分析表1 和图2，三种方法共鉴定出57 种化合物，包括醛类6 种、醇类5 种、酚类2 种、酮类4 种、酸类2 种、酯类15 种、烷烃类13 种、烯烃6 种和其它类4 种。
表1 不同萃取方法绿萼梅挥发性成分Tab. 1 Volatile componentfrom P. mume f. viridicalyxby different extraction method
图1 绿萼梅挥发成分的气质总离子流色谱图Fig. 1 Total ion chromatogram of GC-MS of volatile component from P. mume f. viridicalyx
图2 绿萼梅主要挥发物组成与相对含量Fig. 2 The composition and relative content of main volatiles from P. mume f .viridicalyx
苯甲醛具有明显的苦杏仁味和坚果香，在坚果、茶叶、酒、肉制品等[19-20]食品中均有检出，在蔷薇科植物的茎、皮、花、种子中存在，也常被用作食用和日化香精。在表1 中所有鉴定出的成分中，苯甲醛含量最高，是绿萼梅风味的主要贡献者，在三种方法所获得化合物中分别占79.41%（HS-SPME）、66.99%（SD）和19.59%（SFE）。
三种不同方法提取的绿萼梅花挥发性组分在成分和含量上都存在一定差异。从图3 可以看出，SD 和SFE两种方法获得的挥发物所鉴定出的化合物种类较多，分别为30 种和29 种，而HS-SPME 获得的化合物种类较少，为21 种。在化合物种类方面，用HS-SPME 方法取获得的醛、醇类化合物种类最多，均为5 种，用SD 法获得的酮、酯和烯烃类化合物最多，分别为4 种、9 种和4 种，而用SFE 方法获得的烷烃类物质种类最多，达10 种。从萃取物的相对含量来看，用HS-SPME 方法获得的醛类物质相对含量最高，达86.18%；
其次为SD 法，相对含量为66.99%；
用SFE 法获得的烷烃相对含量最高，达31.46%。烷烃类是植物蜡质的主要组成，超临界二氧化碳对低极性的烷烃类成分萃取效果更佳，而对极性大、沸点较低的醛类化合物萃取效果较差。
图3 绿萼梅花挥发物热图Fig. 3 Heat map of volatile components from P. mume f. viridicalyx
从图3 的聚类热图结果可以明显看出，由于三种提取方法原理不同，所提取化合物的成分组成与含量亦存在着较大的差异。HS-SPME 获得提取物中含量超过1%的化合物共8 种，分别为苯甲醛、壬醛、苯甲酸乙酯、金合欢醇、α-香树脂醇、叶绿醇、苯甲酸甲酯和植酮，其平均相对含量分别为79.41%、6.38%、2.51%、2.44%、1.97%、1.82%、1.19%和1.10%，占总提取物的96.82%；
SD 法获得提取物中含量超过1%的化合物共7 种，分别为苯甲醛、α-香树脂醇、D-柠檬烯、苯甲酸甲酯、植酮、苯甲酸苄酯和二十一烷，其平均相对含量分别为66.99%、13.66%、7.35%、3.48%、1.54%、1.36%和1.34%，占总提取物的95.72%；
SFE 法获得提取物中含量超过1%的化合物共13 种，分别为苯甲醛、二十一烷、金合欢醇、苯甲酸、丁香酚、苯甲酯苄酯、五十烷、十七烷、植酮、硬脂烷醛、二十烷、邻苯二甲酸二丁酯和9-二十三烯，其平均相对含量分别为19.59%、15.76%、11.34%、10.82%、7.88%、6.53%、6.37%、5.04%、3.62%、3.02%、1.45%、1.22%和1.13%，占总提取物的93.77%。
2.2 主成分分析
为了进一步了解3 种萃取工艺的差异，将气相色谱质谱鉴定出的57 种成分，利用Origin 进行主成分分析。从图4 和图5 可以得出，特征值大于1 的主成分共两个，其贡献率PC1 为93.6%，PC2 为5.9%，两个主成分累计贡献率达99.5%，可以很好地代表绿萼梅挥发性成分的信息。图2 中HS-SPME、SD 和SFE 样品主成分得分图中，不同提取方法样品的间距较大，可以明显区分，说明3 种提取方法由于原理的不同，所获得成分差异较大，这与2.1 结果相吻合。
图4 碎石图Fig. 4 Scree plot
图5 得分图Fig. 5 Score plot
图6 为主成分分析载荷图，从图中可以看出，对主成分1 贡献较大的成分为苯甲醛、α-香树脂醇、金合欢醇、苯甲酸和正二十一烷，其载荷分数（loading score）分别为0.905 3、0.103 6、-0.157 6、-0.174 5 和-0.245 2，前2 种成分对主成分1 的贡献是正相的，后3 种成分的贡献是负向的；
对主成分2 贡献最大的成分是苯甲醛、壬醛、金合欢醇、苯甲酸乙酯、苯甲酸、α-香树脂醇、苯甲酸甲酯、D-柠檬烯，其载荷分数分别为0.190 4、0.325 5、0.236 2、0.127 9、0.101 8、-0.718 8、-0.150 1 和-0.442 4。前5 种成分对主成分2的贡献是正向的，后3 种成分的贡献是负向的。综合两个主成分分析结果，苯甲醛、壬醛、金合欢醇、苯甲酸、α-香树脂醇、D-柠檬烯应该是绿萼梅的主要挥发性成分，与表1 的不同提取方法样品中不同化合物的相对含量结果基本吻合。
图6 载荷图Fig. 6 Loadingplot
3.1 顶空-固相微萃取和水蒸气蒸馏法结合更适合绿萼梅花挥发性成分的提取
绿萼梅是我国重要的药用、园林和芳香植物，具有悠久的观赏和药食应用历史[2]。本研究通过对比分析HS-SPME、SD、SFE 三种提取方法获取的绿萼梅花主要挥发性成分，共鉴定出醛、醇、酮、烯、烷等9 类57种化合物。根据主成分分析结果，苯甲醛、壬醛、金合欢醇、苯甲酸、α-香树脂醇、D-柠檬烯是绿萼梅花的主要挥发性成分；
其中含量最高的是苯甲醛，占HS-SPME 提取物的79.41%、SD 提取物的66.99%、SFE 提取物的19.59%。HS-SPME、SD、SFE 三种工艺提取原理不同，所获得化合物的种类与含量亦存在较大差异，HS-SPME是采用吸附原理，吸附剂对其吸附化合物的种类影响较大，本研究采用的是适用于挥发性和半挥发性香味物质的DVB/CAR/PDMS 萃取头，共获得了21 种化合物，主要是分子量较小的醛类、醇类和酯类化合物；
SD 工艺是利用高温将挥发油和水同时蒸馏、冷凝，再利用油水自然分离而获得挥发油的方法，共鉴定出30 种化合物，以酯类、烯烃、酮类等水难溶化合物为主；
SFE 工艺是利用二氧化碳在超临界流体状态的强溶解能力来萃取挥发油的方法，共鉴定出29 种化合物，以与低极性二氧化碳互溶性好的长链烷烃（蜡质）、酯类为主。综合三种方法，SFE 提取物中蜡质含量较高，HS-SPME 和SD 法结合更适合作为植物芳香挥发物的检测手段。
3.2 绿萼梅花中的特征性挥发成分
通过主成分分析，苯甲醛、壬醛、金合欢醇、苯甲酸、α-香树脂醇、D-柠檬烯是绿萼梅花的主要挥发性成分。苯甲醛、壬醛分属于醛类，其中苯甲醛是绿萼梅花中最重要的香气成分，它赋予绿萼梅花特殊的杏仁香和焦甜香，是三种萃取方法获得的挥发性成分中含量最高的物质，它在蔷薇科植物如樱桃Prunuspseudocerasus、岩蔷薇Cistuscreticus等中普遍存在[21]。壬醛呈现柑橘香、花香、焦糖香，该成分仅在HS-SPME 中获得，在其他物种如杜仲Eucommiaulmoides[22]、芫荽Coriandrumsativum[23]中亦是呈味的主要基础物质之一。苯甲酸是最简单的芳香酸，在SFE 萃取物中获得量最高，HS-SPME 萃取物中未检出，由于苯甲酸可以作为前体物质生成各种酯类，如苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯，因此该成分目前还未在其他植物的挥发性成分中检测到，可作为绿萼梅的香气的特征性成分。金合欢醇和α-香树脂醇属于醇类，也是三萜类化合物，是植物中重要的香气物质之一，前者在HS-SPME 和SFE 萃取物中检出，后者在HS-SPME 和SD 萃取物中检出，这也说明HS-SPME 方法利于醇类挥发性成分的吸附。金合欢醇呈现铃兰花香气，并有青香和木香香韵，目前在草豆蔻Alpiniahainanensis挥发油[24]和草豆蔻芳香水[25]中均有检出。α-香树脂醇以游离或成酯形式广泛存在于植物界，也被称为α-香树精，是长白山野菊花Chrysanthemumindicum挥发油中特有的成分之一，在梅叶冬青Ilexasprella[26]、番茄Solanum lycopersicum[27]、油橄榄Canariumoleosum[28]和甜罗勒Ocimumbasilicum[29]等植物中都有发现，在长白山野菊花挥发油中含量为9.02%[30]，高于本研究采用HS-SPME 法获得的得率（1.97±0.33%），而低于SD 法的得率（13.66±1.88%）。D-柠檬烯，大量存在于芸香科柑橘属植物中，是陈皮挥发油的质量标志物之一[31]，本研究采用的3种萃取方法中均有检出，其中以SD 法相对检出率最高。根据载荷分数和主成分分析法确定苯甲醛、壬醛、金合欢醇、苯甲酸、α-香树脂醇、D-柠檬烯6 种成分为绿萼梅特有成分，研究结果可为后续绿萼梅挥发油及香气成分质量评价奠定实验基础。
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