甄庆强，朱冬霞，刘永昌，孙 岩
颈动脉粥样硬化（carotid atherosclerosis, CAS）是指颈动脉内膜下脂质沉积导致动脉管壁增厚、管腔狭窄、血管弹性减退的血管疾病[1]。CAS 是导致缺血性脑卒中的病因之一，也是影响患者卒中后认知功能的因素[2]。来自中国台湾省的10 年随访研究表明，CAS 病变程度可以预测患者的认知能力[3]。降脂、稳定斑块、血管紧张素受体拮抗剂等药物是目前治疗CAS 的一线药物[4-5]，但治疗效果和药物依从性不尽如人意。本课题组前期研究发现，中药瓜蒌皮提取物可降低同型半胱氨酸（homocysteine, Hcy）诱导的动脉粥样硬化模型大鼠的血清Hcy 水平，抑制动脉平滑肌细胞增殖速度[6]，但瓜蒌皮提取物对高Hcy 颈动脉粥样硬化的治疗效果尚不明确。本研究拟通过观察他汀类药物联合瓜蒌皮注射液治疗高Hcy 颈动脉粥样硬化的效果，利用网络药理学和生物信息学思路挖掘瓜蒌皮注射液治疗CAS 的潜在机制，并设计动物实验加以验证，为CAS 的治疗提供新思路。
1.1 临床研究
1.1.1 研究对象 选取2019 年1 月—2021 年1 月于济南市人民医院住院治疗的高Hcy 颈动脉粥样硬化患者120 例。纳入标准：1）符合颈动脉粥样硬化诊断标准，颈动脉狭窄率≤50%[7-8]；
2）Hcy 水平>10 μmol/L[9]；
3）能配合本研究并完成随访者。排除标准：1）服用叶酸、维生素B6 及维生素B12 等降低血清Hcy 水平的药物；
2）颈动脉粥样硬化伴重度狭窄需要手术干预或近3 个月内接受颈动脉手术者；
3）严重肝肾功能不全者；
4）合并急性心脑血管意外或恶性肿瘤者。本研究已获医院伦理委员会批准（批准号：济医伦批SWYX:No.2019-002）。采用随机数字表法将本组患者分为观察组和对照组，每组60例。两组患者年龄、性别、体质量指数（BMI）、病程、合并糖尿病、合并冠心病、合并高血压人数、使用他汀类药物类别及他汀药物剂量比较差异无统计学意义（P>0.05，表1）。
表1 两组患者基线资料比较
1.1.2 治疗方案 对照组患者给予基础治疗：应用他汀类药物稳定斑块；
应用抗血小板聚集药物抑制血小板聚集。观察组在基础治疗基础上，给予瓜蒌皮注射液（国药准字Z20027540）治疗，8 mL 加入5%葡萄糖注射液250 mL 中静脉滴注，1 次/d，治疗周期为3 周。
1.1.3 观察指标 1）检测两组患者治疗前后总胆固醇（total cholesterol, TC）、甘油三酯（triglycerides,TG）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol, LDL-C）、Hcy 水平；
2）采用双侧颈动脉各测量3 次取平均值的方法，使用彩色多普勒超声仪测量颈总动脉颈动脉内膜中层厚度（intima mesosphere thickness, IMT）。
1.2 实验研究
1.2.1 瓜蒌皮干预CAS 的靶点筛选 利用中药系统药理学数据库和分析平台检索瓜蒌皮的有效成分，参照既往文献，将符合药物口服生物利用度和药物相似度类药比的成分纳入研究[10]。登录高通量基因表达数据库（gene expression omnibus, GEO），下载包含CAS 基因数据的数据集GSE100927，利用R 软件limma 数据包[11]对数据进行分析，获得差异表达基因。将瓜蒌皮作用靶点与CAS 差异表达基因取交集，获取瓜蒌皮干预CAS 的靶点。
1.2.2 瓜蒌皮干预CAS“药物-靶点-疾病”网络构建和关键靶点筛选 使用Cytoscape 3.9.2 软件绘制瓜蒌皮干预CAS 的“药物-靶点-疾病”的网络。使用STRING 平台[12]和Cytoscape 3.9.2 软件绘制瓜蒌皮干预CAS 靶点的蛋白-蛋白相互作用（proteinprotein interaction, PPI）网络，以cytoHubba 插件[13]中节点度值（degree）为标准，筛选瓜蒌皮干预CAS 的关键靶点，进行信号通路富集分析。
1.3 动物实验
1.3.1 实验动物 30 只6 周龄无特殊病原体（specific pathogen free, SPF）级SD 雄性大鼠，体质量200～220 g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司[合格证号：370726231100053607，生产许可证号：SCXK（鲁）20220006]。实验大鼠饲养于SPF 级动物房（室温23～25 ℃、相对湿度7%），自由饮水、摄食。
1.3.2 实验试剂 兔多克隆抗体核因子（NF）-κB p65、兔多克隆抗体肿瘤坏死因子（TNF）-α、兔多克隆抗体基质金属蛋白酶9(MMP-9)、兔多克隆抗体血管细胞黏附因子-1(VCAM-1）购自北京博奥森生物技术有限公司（批号：AI00133231、AI10202348、AH27187919、AB12157553）；
SABC 免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，批号：SA1142）；
蛋白浓度测定试剂盒（美国AMERSHAM 公司，批号：RPN2232）；
水合氯醛（上海源叶生物科技有限公司，批号：R21454）。
1.3.3 实验动物分组及造模方法 将30 只实验大鼠随机分为空白组、模型组和治疗组，每组10 只，分笼饲养。参照代渊等[14]、靳宏光等[15]造模方法复制高同型半胱氨酸血症动脉粥样硬化大鼠模型：1.5%蛋氨酸水溶液按照10 mL/kg 体重灌胃，2 次/d；
同时给予高糖高脂饲料（南京协同生物）喂养2 周后，按照3 mL/kg 体重腹腔注射10%水合氯醛麻醉，游离并显露腹主动脉，于主髂动脉分叉处穿刺，置入球囊，上行至肾动脉水平以上，调节压力泵压力至6～8个标准大气压，缓慢抽动球囊3 次，撤出球囊，用7-0无损伤尼龙线缝合穿刺点，检查无出血后，逐层缝合关闭腹腔。术后即刻给予青霉素10 万单位皮下注射、术后3 d 内每天给予青霉素10 万单位预防感染。6 周后，模型组和治疗组各随机选1 只大鼠，自尾静脉取血，检测Hcy 水平，水合氯醛麻醉后取腹主动脉，石蜡包埋、切片、镜下观察。Hcy ＞15 μmol/L，主动脉内膜欠光滑，平滑肌排列紊乱、增生，视为造模成功（图1）。根据人与动物的每公斤体重剂量折算系数，计算得到大鼠瓜蒌皮注射液给药剂量为0.83 mL/kg，生理盐水给药剂量为10 mL/kg。以上述给药剂量为标准，对照组和模型组大鼠每天自尾静脉注射相应剂量的生理盐水，治疗组大鼠每天自尾静脉注射相应剂量的瓜蒌皮注射液，1 次/d，连续给药7 d。
图1 大鼠主动脉HE 染色结果（×400）
1.3.4 指标检测 1）取材：给药7 d 后，麻醉3 组大鼠，将腹主动脉取出并均分为两份，分别保存于4%多聚甲醛和液氮中；
颈椎脱臼处死大鼠。2）免疫组化法检测大鼠腹主动脉NF-κB p65、TNF-α、MMP-9 和VCAM-1 蛋白水平：采用Image J 软件进行平均积分光密度（optical density, OD）值分析。3）蛋白免疫印迹（Western Blot）法测定大鼠腹主动脉中NF-κB p65、TNF-α、MMP-9、VCAM-1 蛋白水平，使用Image J 进行灰度值分析。
1.4 统计分析 采用SPSS 26.0 软件对数据进行统计学分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用独立样本t 检验，前后比较采用配对t 检验；
不符合正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，组间比较及前后比较采用非参数检验；
计数资料以例表示，组间比较采用χ2检验；
P<0.05 表示差异有统计学意义。
2.1 临床研究
2.1.1 两组患者血脂水平比较 治疗前，两组患者TC、TG、LDL-C 和Hcy 水平差异无统计学意义（P>0.05）。治疗后，对照组患者TC 水平较治疗前差异无统计学意义（P>0.05）；
TG、LDL-C 和Hcy 水平较治疗前下降，差异有统计学意义（P<0.05）；
观察组患者TC、TG、LDL-C 和Hcy 水平较治疗前下降，且低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05，表2）。
表2 两组患者血脂水平比较
2.1.2 两组患者IMT 比较 治疗前，两组患者IMT差异无统计学意义（P>0.05）。治疗后，观察组和对照组患者IMT 较治疗前均下降，且观察组患者IMT 水平低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05，表3）。
表3 两组患者IMT 比较（mm）
2.2 实验研究
2.2.1 瓜蒌皮干预CAS 的靶点筛选 获得瓜蒌皮有效成分11 个，靶点422 个。获得CAS 相关差异表达上调基因1248 个，差异表达下调基因887 个，绘制火山图和热图进行可视化。将瓜蒌皮作用靶点与CAS 差异表达基因取交集，获取瓜蒌皮干预CAS 的靶点61 个，其中差异表达上调基因38 个，差异表达下调基因23 个（表4，图2）。
图2 瓜蒌皮干预CAS 的靶点筛选
表4 瓜蒌皮干预CAS 的靶点
2.2.2 瓜蒌皮干预CAS“药物-靶点-疾病”网络构建和关键靶点筛选 使用Cytoscape 3.9.2 软件构建瓜蒌皮干预CAS“药物-靶点-疾病”网络和PPI 网络进行可视化，以节点度值为条件筛选瓜蒌皮干预CAS 的关键靶点。富集分析结果表明，瓜蒌皮干预CAS 的关键靶点显著富集在TNF 信号通路、NF-κB信号通路等通路上（图3）。
图3 瓜蒌皮干预CAS"药物- 靶点- 疾病"网络构建和关键靶点筛选
2.3 大鼠腹主动脉TNF-α、NF-κB p65、VCAM-1、MMP-9 表达量测定
2.3.1 免疫组化结果 模型组和治疗组大鼠腹主动脉TNF-α、MMP-9 表达均高于空白组，差异有统计学意义（P<0.05）；
治疗组和空白组NF-κB p65、VCAM-1 表达差异无统计学意义（P>0.05）；
与模型组相比，治疗组TNF-α、NF-κB、VCAM-1、MMP-9 表达下降，差异有统计学意义（P<0.05，图4）。
图4 瓜蒌皮注射液对大鼠腹主动脉各指标蛋白表达的影响
2.3.2 Western Blot 法检测结果 模型组和治疗组腹主动脉TNF-α、MMP-9 蛋白表达量均高于空白组，差异有统计学意义（P<0.05）；
治疗组和空白组NF-κB p65、VCAM-1 表达差异无统计学意义（P>0.05）；
与模型组相比，治疗组TNF-α、NF-κB、VCAM-1、MMP-9 表达量下降，差异具有统计学意义（P<0.05，图5）。
图5 瓜蒌皮注射液对大鼠腹主动脉各指标蛋白表达的影响（Western Blot 法）
瓜蒌皮是葫芦科植物栝楼（双边栝楼）的果皮，其功效主要包括清化热痰、宽胸散结等[16]。现代药理学研究发现，瓜蒌皮富含木犀草素等黄酮类化合物、苏氨酸等氨基酸、β-谷甾醇等甾醇以及大量挥发油[17]，其提取液可通过抗动脉粥样硬化、保护血管内皮细胞等途径治疗心血管疾病[18]。刘思妤等[19]研究发现，瓜蒌皮乙醇提取物能显著减少人脐静脉内皮细胞中细胞内活性氧、TNF-α 和白细胞介素-6等促炎症细胞因子表达水平，发挥抗炎、抗氧化作用。杨震等[20]研究证实，瓜蒌皮可降低高血脂合并急性心肌缺血模型大鼠超氧化物歧化酶、脂质过氧化物、过氧化氢酶、总抗氧化能力和氧化型低密度脂蛋白水平，改善氧化应激状态，保护心血管。
既往研究证实，高胆固醇血症、高LDL-C 水平、高Hcy 水平与颈动脉粥样硬化密切相关[21-23]。颈动脉内中膜厚度是CAS 严重程度的重要指标，Hcy水平与颈动脉内中膜厚度及斑块形态和面积线性相关[23-25]。本研究结果表明，他汀类药物可降低合并高Hcy 的CAS 患者TG、LDL-C、Hcy 水平。联合应用瓜蒌皮提取物，可显著降低CAS 伴高Hcy 血症患者TC、TG、LDL-C 和Hcy 水平，治疗效果优于单用他汀类药物。表明瓜蒌皮提取物可通过调节血脂和Hcy 水平等途径改善CAS。同时，他汀类药物联合应用瓜蒌皮提取物可减小颈动脉内中膜厚度，延缓CAS 进展。
本研究通过生物信息学和网络药理学研究思路挖掘了瓜蒌皮干预CAS 的潜在机制，并设计实验加以验证。结果提示，瓜蒌皮干预CAS 的关键靶点显著富集在TNF/NF-κB 信号通路上。炎性反应贯穿动脉粥样硬化的发病过程。单核细胞等炎性相关细胞通过TNF-α、白细胞介素-6 等因子参与活性氧簇介导的细胞损伤，并向巨噬细胞转化[26]；
斑块内的巨噬细胞吞噬脂质，当脂质累积过多超过巨噬细胞的处理能力时，巨噬细胞泡沫化，形成泡沫细胞[27]；
斑块内活化的炎症细胞分泌基质金属蛋白酶，降解细胞外基质和斑块的纤维帽，降低斑块的稳定性，增加其破裂的几率[28-29]。TNF/NF-κB 信号通路是经典的炎症反应通路。动物实验验证，动脉粥样硬化模型大鼠腹主动脉组织TNF-α、NF-κB p65、VCAM-1、MMP-9 表达显著上调，瓜蒌皮注射液可抑制上述指标的表达，提示其可以通过抑制TNF/NF-κB 信号通路的激活发挥抗动脉粥样硬化的作用。