佘丹，王舒婷，陆信曜，宗红，诸葛斌
（江南大学生物工程学院，工业生物技术教育部重点实验室，工业微生物研究中心，江苏 无锡 214122）
1,2,4-丁三醇（1,2,4-butanetriol，BT）是一种无色、无味的非天然化合物，性质与甘油相似，广泛应用于军工、医药等领域[1]。孙雷等[2]前期研究在大肠杆菌中过表达木糖脱氢酶（Xdh）和苯甲酰甲酸脱羧酶（KivD）（图1），同时弱化葡萄糖转运系统（PTS）、敲除副产物途径[3]，使得BT 产量达到14.5g/L、转化率达到75%。
图1 大肠杆菌以木糖为底物代谢合成BT的途径
上述BT生物合成途径以木糖为底物，成本高，不利于规模化生产。玉米芯富含半纤维素，酸水解后获得大量木糖[4]，但会产生有毒抑制物质如糠醛[5]，限制菌株生长和发酵[6]。Zhao等[7]利用产甘油假丝酵母对纤维素水解液脱毒，再利用大肠杆菌进行发酵获得了4.7g/L 的BT。此两步发酵法耗时长，产量较低。为实现一步法发酵纤维素水解液生成BT，本研究利用上述重组大肠杆菌进行改造以提高其糠醛耐受和生产水平。
在大肠杆菌中存在不同类型的糠醛耐受相关基因，包括糠醛还原酶YghA 等[8-9]，缓解糠醛胁迫下DNA 损伤的胸苷酸合酶ThyA[10]，参与物质转运的天然外排泵蛋白MdtJI[11]以及催化NADH 和NADPH相互转化的转氢酶PntAB 等[12]。本研究在BT 合成菌株中过表达上述四种基因，以改善重组菌对糠醛的耐受能力，提高纤维素水解液发酵生产BT 的水平，为后续研究提供借鉴。
1.1 试剂与仪器
卡那霉素、氯霉素、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），生工生物工程（上海）股份有限公司；
蛋白胨、酵母提取物，Oxiod公司；
1,2,4-丁三醇，上海阿拉丁化学试剂有限公司；
玉米芯粉末，江苏连云港苏锐秸秆加工厂；
一步法克隆试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒，江苏康为世纪生物科技有限公司；
限制性内切酶，大连宝生物工程有限公司（Takara）；
Bradford蛋白浓度测定试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司；
其他试剂均为国产分析纯。
1.2 菌株与质粒
本研究中所使用的菌株和质粒如表1所示。
表1 本研究所用菌株和质粒
1.3 培养方法
种子培养基（LB培养基）：蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，氯化钠10.0g/L。
发酵培养基：蛋白胨15.0g/L，酵母提取物7.5g/L，氯化钠15.0g/L，碳酸钙10.0g/L，葡萄糖10.0g/L，木糖30.0g/L。
种子培养：从LB 固体平板上挑取单菌落转接到种子培养基中，37℃、200r/min培养12h。
摇瓶发酵培养：250mL三角瓶中装液量为50mL，1%（体积分数）接种量；
37℃、200r/min 培养至OD600为0.6～0.8 时，加入终浓度为0.5mmol/L IPTG进行诱导，同时加入木糖和葡萄糖。
5L 发酵罐培养：5L 发酵罐装液量为2.5L，将种龄12h 的一级种子液按照1%（体积分数）接种量转接到二级种子液中，培养8h。二级种子液按照10%（体积分数）接种量转接到发酵罐中，发酵温度为30℃，转速设置400r/min，通气量为3L/(L·min)，用酸和碱溶液维持pH在7.0左右。
补料培养：在发酵培养24h后一次性补加浓度为10g/L葡萄糖和30g/L木糖。
1.4 水解液的制备
向60 目的玉米芯粉末中加入2%（体积分数）H2SO4至固液比为1∶10，121℃下蒸煮1h[4]。随后过滤收集滤液并用碱溶液石灰水调节pH 至11.0，进一步过滤去除沉淀。最后在50℃下搅拌浓缩[13]，获得所需浓度的玉米芯纤维素水解液母液，经过100℃、30min灭菌后按照培养条件要求加入到培养基中。母液储存在 -20℃以便后续使用。
1.5 分析方法
OD600利用分光光度计测定发酵液在波长600nm下的吸光度。发酵液中葡萄糖、木糖和BT 用高效液相色谱示差法检测，流动相为5.0mmol/L H2SO4，流速为0.6mL/min，色谱柱为Aminex HPX-87H，柱温60℃，进样量为20μL。菌液处理方法为，在8000r/min和4℃条件下离心收集对数期的菌体，用0.1mol/L 磷酸盐缓冲溶液（PBS）清洗2 次后重新悬浮，再用超声破碎仪破碎20min，离心得到的上清液为粗酶液[14]。蛋白浓度通过Bradford 蛋白浓度检测试剂盒测定。
木糖脱氢酶Xdh 酶活力的测定反应体系为100mmol/L 木糖、2mmol/L MgCl2、100mmol/L Tris-HCl（pH=8.1）、1mmol/L NAD(P)+以及100μL粗酶液；
Xdh的酶活力定义为每分钟转化1μmol/L木糖所需的酶量为1 个酶活力单位。醇脱氢酶YqhD 酶活力的测定反应体系为50mmol/L 3-(N-吗啉)丙磺酸缓冲溶液（pH=7），100mmol/L丁醛，0.25mmol/L NAD(P)H以及100μL粗酶液；
YqhD的酶活力定义为每分钟转化1μmol/L NAD(P)H所需的酶量为1个酶活力单位[15]。
通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测yjhG和kivD基因的相对转录水平。总RNA通过Trizol试剂提取。以RNA 为模板，通过Hiscript Ⅱ qRT SuperMix Ⅱ合成相应的cDNA。以cDNA 为模板，使用16S rRNA作为内参进行qRT-PCR。
使用SPSS23 统计软件对实验结果进行统计学分析，检测时选择ANOVA 和Duncan 检验，当P＜0.05 时认为实验结果之间具有显著性差异，反之则没有显著性差异。
2.1 不同重组菌对糠醛的耐受能力
糠醛胁迫下，与对照菌E.coliKXW3009P0 相比，所有糠醛耐受基因的过表达都能不同程度地提高菌株生物量（图2），生长的改善使得葡萄糖和木糖的消耗也增加。其中过表达pntAB的E.coliKXW3009P5的生长和BT合成最具优势，生物量提高了50.3%；
BT产量11.0g/L，提高了59.7%。菌株E.coliKXW3009P1、E.coliKXW3009P2 和E.coliKXW3009P3 的生物量分别提升了13.4%、8.1%、18.3%，但BT产量均仅有小幅变化。
图2 不同重组菌株在0.4g/L糠醛下的发酵结果（*P＜0.05）
大肠杆菌自身还原糠醛和丁醛主要依赖于以NADPH为辅因子的YqhD，还原过程与生长竞争还原力[16]。YghA 以NADH 为辅因子，过表达yghA时加快了糠醛还原并减少NADPH 的消耗[9]，这对于细胞生长是有利的。同时BT途径的Xdh、YqhD和KivD 的酶活力或转录水平均显著提升（图3），尤其是关键酶Xdh的酶活力提高了2.1倍，促进了BT的合成[17]。
图3 0.4g/L糠醛下不同重组菌株中关键酶的酶活力与转录（*P＜0.05，#P＜0.05）
糠醛能造成DNA 损伤，过表达thyA可促进dTTP的合成以加快DNA修复[10]。外排泵MdtJI能主动从胞内将糠醛转运到胞外[11]，因此这两个基因有助于糠醛胁迫下的菌体生长。但thyA和mdtJI使得BT合成关键酶KivD转录明显降低，造成细胞合成BT能力减弱[17]，单位OD600产量分别下降11.1%和14.5%。
糠醛的还原可能使得胞内NADH/NADPH 处于不平衡状态，吡啶核苷酸转氢酶PntAB能将胞内更多的NADH 转化为NADPH[18]，来满足生长和糠醛还原对NADPH 的需求。过表达PntAB使得Xdh 和YqhD的酶活力分别提高了2.6倍和1.1倍，KivD的转录也提高了53.0%，进而增强了BT的合成效率，使得单位OD600产量提高5.1%。
过表达yghA和pntAB基因的菌株表现出明显的糠醛耐受，为探索不同耐受基因与糠醛耐受性的相关性，将所有菌株在无糠醛压力下进行发酵（表2）。
所有糠醛耐受基因的过表达均未明显提高BT产量，表明这些基因对BT 代谢途径没有明显影响，推测yghA和pntAB基因在糠醛压力下是通过改善菌株生长进而提高糠醛耐受性。
2.2 重组菌利用纤维素水解液发酵生产1,2,4-丁三醇
为考察以上4种基因在纤维素水解液复杂环境下的耐受情况，以玉米芯纤维素水解液为底物进行发酵。与对照菌株E.coliKXW3009P0 相比，过表达yghA、thyA和pntAB的三株菌株在生物量和BT产量上有明显的提升（图4，表3），其中过表达yghA的菌株生物量提高了66.1%，获得最高的BT产量3.36g/L，木糖转化率达到23.4%。随着生物量的增加，葡萄糖和木糖消耗也均有显著提升。
表3 不同重组菌株在纤维素水解液中发酵结束时的参数
图4 不同重组菌株的纤维素水解液发酵结果（*P＜0.05，#P＜0.05）
过表达yghA基因对BT途径酶的酶活力或转录水平的提高均有利（图5），获得最高单位OD600的BT 产量。纤维素水解液中乙酸等复杂组分会降低大肠杆菌中外源基因的表达效率[19]，过表达thyA或pntAB基因时，KivD的转录水平相对较低，导致单位OD600的BT产量分别下降了17.7%和5.9%。过表达mdtJI时对大肠杆菌在玉米芯纤维素水解液中的生长与发酵没有明显的改善，这与在0.4g/L糠醛压力下的发酵结果较为相似。
图5 不同重组菌株纤维素水解液中的关键酶的酶活力与转录（*P＜0.05，#P＜0.05）
2.3 5L发酵罐发酵纤维素水解液生产1,2,4-丁三醇
基于摇瓶发酵结果，选择过表达yghA基因的E.coliKXW3009P1 进行放大培养（图6）。BT 的合成为生长偶合型[20]，需要进行补料培养，通过生物量与葡萄糖浓度的监测，选择在24h 补料。在5L发酵罐中，与摇瓶相比，生长、糖耗和BT 生产速率都明显提升，最终BT 产量增加了3.6 倍，达到15.3g/L，转化率为63.8%，增加了1.7 倍，放大培养后明显提高了玉米芯纤维素水解液中木糖的利用率。以水解液为底物的5L 发酵结果与纯化后的木糖发酵结果相比，生长更具有优势，糖耗和BT 产量没有明显差异，表明水解液中菌株的BT 合成能力受到一定程度的抑制。
图6 E. coli KXW3009P1菌株以玉米芯纤维素水解液为底物的5L发酵过程
在大肠杆菌生产BT过程中过表达yghA、thyA、mdtJI和pntAB这四种基因，均提高了糠醛耐受性。携带pntAB的菌株在加入0.4g/L 糠醛的培养基中获得了最高的BT 产量，然而在玉米芯纤维素水解液中这些菌株的生长与代谢趋势和在0.4g/L糠醛压力下存在一些差异，其中过表达yghA基因的菌株表现出最好的生长与BT 产量，BT 产量达到3.36g/L。在5L发酵罐中，过表达yghA基因促进了细胞生长和对纤维素水解物中木糖的利用，BT 产量达到15.3g/L。这些结果为工业上利用玉米芯纤维素水解物生产BT提供了参考。
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