李敏 孙江漫 孟祥兆 邵燕 于洪远
维生素D 是一种类固醇激素，25（OH）D 是机体维生素D 的主要储存形式，由于25（OH）D 半衰期长，不受血钙和甲状旁腺素水平的影响，被公认为是客观评价维生素D 营养状况的最佳指标［1］。最新研究显示，除了对骨骼的影响，维生素D 缺乏或缺失与许多疾病的风险增加有关，包括癌症、心血管疾病、糖尿病、传染性疾病和自身免疫性疾病［2］。随着人们对维生素D 重要性的认识加深，维生素D 的检测量也与日俱增。目前25（OH）D 的检测方法主要分为两种：免疫法和液相色谱串联质谱法，不同的方法学间由于检测原理和系统的差异，实际检测过程中可靠性存在明显差异［3］，国内已有较多关于两种方法检测结果一致性的报道［4-5］。对于同一检测系统，由于样本的前处理方式不同，也会导致检测结果的差异，但这些差异经常被忽视。本文研究前因素对免疫法和质谱法检测25（OH）D 的影响，旨在最大限度地保证标本质量，提高检测结果的可靠性。
1.1 仪器
电化学发光全自动免疫分析仪Cobas e601（罗氏诊断产品有限公司）、TQD 串联ACQUITY UPLC 液相色谱质谱联用仪（沃特世科技有限公司）、L-128 型氮吹仪（博纳艾杰尔科技有限公司）、移液器（艾本德中国有限公司）、高速冷冻离心机（艾本德中国有限公司）、A10 超纯水机（密理博中国有限公司）。
1.2 试剂
25（OH）D 试剂盒（货 号：05894913190）、校准品（货号：05894921190）及质控品（货号：05618860190）均来自罗氏诊断产品有限公司；
25（OH）D2（货号：DLM-9114-C）、25（OH）D3（货号：DLM-9116-C）的同位素内标购自CIL 公司，标准品（货号：H-073、H-083）购自Sigma 公司；
甲醇（货号：A456-4）、甲酸（货号：A117-50）、正己烷（货号：H302-4）购自美国ThermoFisher 公司。
1.3 标本
收集北京航天总医院2022 年1 月份住院患者血清和血浆标本作为研究对象，纳入标准：①无慢性肝、肾、心等严重疾病；
②近期无感染性疾病史；
③近期无发热史。所有标本均无溶血、乳糜和黄疸。本研究经院伦理委员会审批后进行，所有研究对象对检测均知情同意。
1.4 方法
1.4.1 标本分组
所有标本按照不同离心温度、不同采血管类型、采集后不同离心时间间隔、离心后不同储存温度分为4 组，每组的标本量为40 例。常规标本的处理步骤为研究对象空腹采集EDTA-K2抗凝血2管，每管采血量2 mL。标本送达实验室后立即离心，离心温度为4℃，离心半径21 cm，3 000 r/min离心10 min，选择上层血浆进行检测。离心后标本储存温度为2～8℃。标本处理完成后分别采用免疫法和质谱法检测25（OH）D 总量。
1.4.1.1 不同离心温度 两支标本的离心温度分别为室温（18～27℃）和4℃，其它均按常规标本的步骤处理。
1.4.1.2 不同采血管类型 纳入该组的研究对象分别空腹采集EDTA-K2抗凝血和促凝血各1 管，采集后均按常规标本的步骤处理。
1.4.1.3 采集后不同离心时间间隔 两支标本采集后的离心间隔分别为立即离心和常温放置8 h后离心，其它均按常规标本的步骤处理。
1.4.1.4 离心后不同储存温度 两支标本离心后储存温度分别为常温和2～8℃，其它均按常规标本的步骤处理。
1.4.2 免疫电化学发光法
按照实验室标准操作规程，对仪器进行校准并测量试剂盒配套质控品，质控合格后对标本进行检测。
1.4.3 液相色谱串联质谱法
取200 μL 待测标本转移至对应的1.5 mL 离心管，加20 μL 混合内标溶液，涡旋混匀；
往上述离心管中加入200 μL 甲醇，振荡混匀；
蛋白质沉淀后加入800 μL 正己烷，涡旋混匀10 min；
4℃、离心半径8 cm、13 000 r/min 的条件下离心10 min；
吸取600 μL 上清液于新的离心管中，氮气吹干；
加入100 μL 75%甲醇复溶，4℃、离心半径8 cm、13 000 r/min 的条件下离心5 min，取80 μL 上清液上机检测，总25（OH）D 的含量为25（OH）D2和25（OH）D3的总和。
1.5 统计学处理
采用SPSS 22.0 统计软件进行数据分析。正态分布的计量数据采用（）表示，两组间比较采用配对t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。
2.1 四种因素对免疫法检测结果的影响
室温离心组的25（OH）D 总量高于4℃离心组，差异有统计学意义（P＜0.05）。使用促凝管采血组的25（OH）D 总量高于抗凝管组，差异有统计学意义（P＜0.05）。采集后常温放置8 h 组的25（OH）D 总量高于即刻离心组，差异有统计学意义（P＜0.05）。离心后常温储存组的25（OH）D 总量高于2～8℃储存组，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。
表1 四种因素对免疫法检测结果的影响（）Table 1 The influence of four factors on the results of immunoassay detection（）
表1 四种因素对免疫法检测结果的影响（）Table 1 The influence of four factors on the results of immunoassay detection（）
2.2 四种因素对质谱法检测结果的影响
室温离心组的25（OH）D 总量高于4℃离心组，差异无统计学意义（P＞0.05）。使用促凝管采血组的25（OH）D 总量高于抗凝管组，差异无统计学意义（P＞0.05）。采集后常温放置8 h 组的25（OH）D 总量高于即刻离心组，差异无统计学意义（P＞0.05）。离心后常温储存组的25（OH）D 总量高于2～8℃储存组，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。
表2 四种因素对质谱法检测结果的影响（）Table 2 The influence of four factors on the detection results of mass spectrometry（）
表2 四种因素对质谱法检测结果的影响（）Table 2 The influence of four factors on the detection results of mass spectrometry（）
2.3 两种方法的比对
免疫法与质谱法检测25（OH）D 结果的平均偏差为-3.0 nmol/L（-7.48%）。以免疫法的测定结果为X 轴，质谱法的测定结果为Y 轴，对两种方法采用Passing-Bablok 回归分析，见图1。线性回归方程为Y=0.082+1.133X，斜率的95%CI 为1.025～1.250，截距的95%CI 为-2.337～2.829，相关系数r=0.880。
图1 检测25（OH）D 的Passing-Bablok 回归图Figure 1 Passing-Bablok regression plot of 25（OH）D detected
影响实验室检测结果准确性的因素主要有人员、仪器、试剂、方法、标本质量等方面［6］。分析前的各种环节涉及较多，有报道称可以通过强化分析前的规范化来控制对检测结果的影响［7］，但目前看来实施难度较大。研究表明，临床反馈不满意的检测结果约70%～80%的报告可溯源至样本分析前的阶段［8］。
本研究结果显示，使用免疫法检测25（OH）D，室温离心组、使用促凝管采血组、采集后常温放置8 h 组的25（OH）D 总量高于4℃离心组、抗凝管组、即刻离心组，差异有统计学意义。分析原因认为，处理标本时使用常温离心机，随着转速的增加，离心温度逐渐升高，可能会导致细胞发生破坏；
全血样本常温放置8 h 后，细胞也易发生破坏，产生肉眼不可见的溶血，释放内源性干扰物质，影响检测结果。既往研究显示［9］，使用西门子检测系统对25（OH）D 进行免疫测定时，使用VACUETTE 品牌的促凝管采血组结果显著高于无添加管组。本研究中采用罗氏检测系统和BD 公司的采血管，使用促凝管采血组的25（OH）D 总量显著高于EDTA 抗凝管采血组，分析原因可能是由于促凝管中的凝胶和凝块激活剂增加了磁性颗粒标记的抗体和发光剂之间的非特异性交叉反应，导致化学发光值增加。
使用质谱法检测25（OH）D，室温离心组、使用促凝管采血组、采集后常温放置8 h 组、离心后常温储存组的结果高于4℃离心组、抗凝管组、即刻离心组、2～8℃储存组，差异均无统计学意义。样本前处理是质谱法检测的重要环节之一，常见的方法有蛋白沉淀法、液液萃取法、固相萃取法［10］。本研究中样本前处理包括两步，首先是加入甲醇进行蛋白沉降，其次是使用正己烷液液萃取。经过两步处理后，充分去除血液标本中蛋白等杂质的干扰，减少基质效应。赵蓓蓓等［11］研究结果显示，检测25（OH）D 时，质谱法与免疫法相比，受基质和内源性待测物的影响较小，可靠性更好。李思燃等［12］研究也表明25（OH）D 只有在维生素D 受体释放时才能准确测定，质谱法可通过沉淀蛋白等前处理方法处理此问题，从而达到准确测量的目的。
本研究结果与禹松林等［13-14］的报道结果相一致，提示免疫法与质谱法的比较中存在比例系统误差［15］。
目前，免疫法和质谱法是国内外检测25（OH）D 的主要方法。免疫法的检测原理是抗原抗体反应，抗体特异性低、其他代谢物干扰、不能区分25（OH）D2和25（OH）D3是免疫法面临的最大挑战。液相色谱串联质谱法结合了色谱对物质的高分离能力和质谱对物质结构和质量的分析能力，有较高的灵敏度和特异性，能同时测定25（OH）D2和25（OH）D3，更全面地反映体内25（OH）D 的状况。本研究结果表明，质谱法抗干扰能力强，不同的分析前因素对质谱法检测结果的影响无统计学意义。但质谱法存在仪器价格昂贵、人员专业要求高等缺点，在临床推广难度大。目前检验科常规检测中免疫法仍占较大比例，使用免疫法检测时应加强对分析前因素的重视，积极与临床科室沟通，提高分析前样本的的质量，以更好地为患者提供精准的检测结果。
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