李兆龙 徐义策 李泽文 周洁
顺铂(cisplatin,CIS)是多种恶性肿瘤的一线化疗药物,可引起进行性的、不可逆的和累积性的听力损伤,这种耳毒性是限制其临床应用的重要原因[1]。目前尚无针对CIS耳毒性的有效预防措施,因此有必要寻找减轻或阻止CIS耳毒性的保护剂,以突破CIS化疗的剂量限制。研究[2,3]表明,CIS可在耳蜗中蓄积并长期存在,诱导耳蜗毛细胞(cochlear hair cell,CHC)和螺旋神经节神经元(spiral ganglion neuron,SGN)过度产生并积累活性氧(reactive oxygen species,ROS),导致细胞丢失或死亡,进而损害听力。中药提取物红景天苷(salidroside,SAL)具有抗氧化、抗凋亡、抗炎、神经保护等功效[4]。已证实,SAL可改善氨基糖苷类药物[5]及金属锰[6]的耳毒性,推测其对CIS的耳毒性也有改善作用。CHC的支持功能和SGN的传导功能依赖于细胞存活,是听力维持的生理基础[7]。环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)为重要的第二信使,可诱导蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)/cAMP效应元件结合蛋白(cAMP response element-binding protein,CREB)信号通路激活,促进下游抗凋亡蛋白(Bcl-2)和神经保护因子(BDNF、NF)的表达,预防细胞(包括神经元)凋亡,有利于细胞存活[8,9]。然而,SAL对CIS耳毒性的改善作用是否与cAMP/PKA/CREB通路有关并不清楚。故本研究拟采用CIS处理离体耳蜗组织,观察SAL干预对CIS所致CHC、SGN损伤和cAMP/PKA/CREB通路的影响,以探讨SAL改善CIS耳毒性的可能机制。
1.1实验动物 SPF级新生2 d的C57BL/6小鼠50只,由华中科技大学同济医学院实验动物中心馈赠。
1.2试剂和仪器 SAL(纯度≥98%)购自Sigma公司;特异性cAMP抑制剂SQ22536、PKA抑制剂H-89购自MCE公司;神经元β3-tubulin抗体、羊抗兔(Alexa Fluor 647或Alexa Fluo 488或HRP偶联)IgG抗体、DAPI、NF-M抗体购自CST公司;肌球蛋白(myosin7a,MYO7A)、BDNF抗体、ROS检测CellROXTMDeep Green试剂盒购自Invitrogen公司;cAMP ELISA试剂盒、GAPDH抗体、PKA抗体、p-CREB抗体、CREB抗体、Bcl-2抗体购自Abcam公司;化学发光试剂购自Millipore公司;蛋白提取试剂购自上海生工公司;激光共聚焦显微镜购自奥林巴斯公司;电泳和转膜设备购自BioRad公司。
1.3实验方法
1.3.1耳蜗基底膜的分离和培养[10]将新生2 d的C57BL/6小鼠断头处死,75%酒精消毒全身后,固定头部并暴露双侧颞骨,解剖镜下分离双侧听泡置于Hank’s平衡液中,小心去除螺旋韧带等,分离出条状的耳蜗基底膜[含有内毛细胞(IHC)、外毛细胞(OHC)及SGN]。将耳蜗基底膜(Corti器面朝上)平铺在含有胶原蛋白的无血清BME培养液凝胶表面,轻压固定,在培养箱中过夜(37℃,5%CO2)。次日,更换新鲜培养液并加入CIS或SAL进行干预。
1.3.2分组及给药 随机数字法将耳蜗基底膜分为对照组(C组)、CIS组、SAL组、SAL+SQ22536(cAMP抑制剂)组和SAL+H-89(PKA抑制剂)组,每组20条。C组仅加入无血清BME培养液;CIS组在培养液中加入15 μmol/L CIS[11];SAL组在CIS组基础上加入5 μmol/L SAL[7];SAL+SQ22536组在CIS组基础上加入5 μmol/L SAL和5 μmol/L SQ22536;SAL+H-89组在CIS组基础上加入5 μmol/L SAL和30 μmol/L H-89。在培养箱中孵育48 h后进行后续实验。
1.3.3免疫荧光染色 用4%多聚甲醛固定各组耳蜗基底膜(n=10,β3-tubulin、MYO7A各5条),用PBS、Triton X-100处理后,加入羊血清封闭45 min;滴加一抗兔抗小鼠神经元β3-tubulin(1∶800)或兔抗小鼠MYO7A(1∶50)作用过夜、滴加二抗(Alexa Fluor 647偶联抗兔IgG或Alexa Fluo 488偶联抗兔IgG,稀释比1∶500)避光作用2 h,并用DAPI(1∶1 000)核染色剂作用10 min,封片后在共聚焦显微镜下拍照。计数CHC(MYO7A标记的完整细胞)和SGN(β3-tubulin标记的完整细胞)数量。
1.3.4ROS含量检测 多聚甲醛固定各组耳蜗基底膜(n=5),用PBS处理后,加入CellROXTMDeep Green工作液(绿色荧光)避光作用30 min,加入DAPI(1∶1 000)核染色剂作用10 min,封片后在共聚焦显微镜下拍照。用Image J分析绿色荧光强度,以评估耳蜗基底膜中ROS含量。
1.3.5cAMP含量检测 将处理好的基底膜从凝胶表面小心剥离,用RIPA裂解液裂解各组耳蜗基底膜(n=5),离心上述裂解液,收集上清,按照指导书依次加入cAMP ELISA工作液,在酶标仪读取OD450nm,计算cAMP含量。
1.3.6Western blot检测 收集1.3.5所得裂解液上清并用BCA试剂盒测定蛋白浓度。用SDS-PAGE凝胶电泳分离等量的蛋白样品(30 μg),并转移到PVDF膜;用封闭液(5%脱脂奶粉)封闭后,相继加入一抗[GAPDH抗体(1∶2 000)、PKA抗体(1∶1 000)、p-CREB抗体(1∶500)、CREB抗体(1∶500)、Bcl-2抗体(1∶500)、BDNF抗体(1∶1 000)、NF-M抗体(1∶1 000)]、HRP标记二抗(1∶3 000);用化学发光液显影蛋白条带并拍照。以GAPDH为内参分析PKA等蛋白条带相对灰度。
2.1各组基底膜毛细胞免疫荧光染色观察结果 C组耳蜗基底膜中可见三排OHC和单排IHC有序紧致排列,CHC形态规则;CIS组CHC排列混乱,分层不清楚,体积肿大;SAL组CHC排列及形态趋于规则;SAL+SQ22536组和SAL+H-89组CHC排列及形态较SAL组差(图1)。与C组相比,CIS组CHC数量较少(P<0.05);与CIS组相比,SAL组CHC数量较多(P<0.05);与SAL组相比,SAL+SQ22536组和SAL+H-89组CHC数量较少(P<0.05)(表1),说明SAL可以减轻CIS引起的耳蜗毛细胞损伤。
图1 各组基底膜免疫荧光染色观察CHC形态
表1 各组CHC、SGN数量及ROS相对荧光强度比较
2.2各组基底膜SGN免疫荧光染色观察结果 C组耳蜗基底膜中可见密集分布的圆形或椭圆形的SGN,细胞质、核染色均匀,可见大量由胞体延伸出的神经突;CIS组个别SGN细胞核破碎,大量SGN的神经突缺失;SAL组SGN形态趋于正常;SAL+SQ22536组和SAL+H-89组SGN形态较SAL组差(图2)。与C组相比,CIS组SGN数量较少(P<0.05);与CIS组相比,SAL组SGN数量较多(P<0.05);与SAL组相比,SAL+SQ22536组和SAL+H-89组SGN数量较少(P<0.05)(表1),说明SAL可以减轻CIS引起的耳蜗SGN损伤。
图2 各组基底膜免疫荧光染色观察SGN形态
2.3各组ROS含量检测结果 由表1可见,与C组相比,CIS组ROS含量较高(P<0.05);与CIS组相比,SAL组ROS含量较低(P<0.05);与SAL组相比,SAL+SQ22536组和SAL+H-89组ROS含量较高(P<0.05)(图3、表1),说明SAL可改善GIS引起的氧化损伤。
图3 CellROXTM Deep Green试剂盒检测耳蜗基底膜ROS含量
2.4各组cAMP/PKA/CREB信号通路检测结果 由表2可见,与C组相比,CIS组cAMP含量、PKA蛋白及p-CREB/CREB水平较高(P<0.05);与CIS组相比,SAL组cAMP含量、PKA蛋白及p-CREB/CREB水平较高(P<0.05);与SAL组相比,SAL+SQ22536组cAMP含量、PKA蛋白及p-CREB/CREB水平较低(P<0.05),SAL+H-89组PKA蛋白及p-CREB/CREB水平较低(P<0.05)(图4、表2),说明SAL激活了cAMP/PKA/CREB信号通路。
表2 各组cAMP含量、PKA、p-CREB、CREB蛋白水平比较
图4 Western blot检测各组PKA、p-CREB、CREB蛋白水平
2.5各组BDNF、NF-M、Bcl-2蛋白表达检测结果 由表3可见,与C组相比,CIS组BDNF、NF-M、Bcl-2蛋白水平较高(P<0.05);与CIS组相比,SAL组BDNF、NF-M、Bcl-2蛋白水平较高(P<0.05);与SAL组相比,SAL+SQ22536组、SAL+H-89组BDNF、NF-M、Bcl-2蛋白较低(P<0.05)(图5、表3),说明SAL促进了BDNF、NF-M、Bcl-2蛋白的表达。
表3 各组BDNF、NF-M、Bcl-2蛋白水平比较
图5 Western blot检测各组BDNF、NF-M、Bcl-2蛋白水平
据报道,约40%～80%的CIS化疗患者会出现永久性听力损伤[12]。本研究中,CIS组CHC和SGN数量显著减少且排列混乱,大量SGN的神经突缺失,同时ROS含量增加了3.8倍,这是因为耳毒性药物可引起耳蜗组织中ROS/氮物质的积累、线粒体功能障碍等,造成CHC和/或SGN损伤[3,13]。
中药红景天具有“扶正益本、补气生血”等功效,SAL为其糖苷提取物,可通过抗焦亡、抗氧化、抗代谢应激等对大脑[14]、耳[6]、肝脏[15]等产生保护作用。本研究中SAL的作用浓度为5 μmol/L,这是由于Ding等[5]通过一系列实验确定了5 μmol/L SAL预处理能显著减轻锰诱导的耳毒性,故本实验中采用这一浓度。既往研究[3,13]已证实,ROS在CIS所致听神经损害中发挥关键作用,其水平增加最终导致CHC和SGN凋亡和死亡,抑制其可减轻CIS所致的听神经损害。本研究显示,与CIS组相比,SAL组ROS含量降低了2.5倍,CHC和SGN数量和形态均明显改善,表明SAL可以降低CIS诱导的CHC和SGN内ROS含量,从而起到保护CHC和SGN的作用,缓解CIS引起的耳毒性。
cAMP/PKA/CREB通路的活化通过PKA介导的CREB磷酸化实现,它作为转录因子调节各种基因[16]。正常生理环境下,PKA以无活性的形式存在于细胞中;遇刺激时,cAMP在细胞中积累增加,与调节亚基结合释放出具有活性的PKA,催化CREB蛋白的Ser133发生磷酸化(p-CREB),p-CREB与BDNF、NF、Bcl-2等靶基因启动子区特定序列结合并启动转录,提高细胞的抗凋亡能力和存活能力[8,9,16],是细胞损伤后启动的自我修复。BDNF和NF是重要的神经营养因子,有利于神经元的生长、分化和存活,维持神经元的功能和可塑性,是细胞应对多种伤害性刺激的保护因子[17]。Bcl-2为重要的抗凋亡蛋白,通过阻止细胞凋亡促进细胞存活[8]。本研究结果中,CIS组耳蜗基底膜中cAMP含量及PKA、p-CREB/CERB、BDNF、NF-M、Bcl-2蛋白水平增多,可能因为CIS产生的ROS等有害物质激活了自我保护性cAMP/PKA/CREB信号通路,但不足以抵抗CIS造成的CHC和SGN损伤。而SAL可以进一步增加耳蜗基底膜中cAMP含量、PKA、p-CREB/CERB蛋白水平及下游靶蛋白BDNF、NF-M、Bcl-2的表达,说明SAL的保护作用导致cAMP/PKA/CREB信号通路进一步活化,有助于减轻多种条件诱导的细胞凋亡[18,19]。本研究还发现,SAL的上述保护作用可被cAMP抑制剂SQ22536或PKA抑制剂H-89减弱,提示激活cAMP/PKA/CREB信号通路可能是SAL改善CIS耳毒性的机制之一。
综上所述,SAL可能通过cAMP/PKA/CREB通路促进抗凋亡蛋白和神经保护因子表达,缓解CIS引起的CHC和SGN损伤,且SAL也具有抗癌活性[20],并可增强顺铂的抗癌作用[21],提示SAL可能可以作为预防CIS耳毒性的药物。
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