林威,常海龙,黄晨宇,李保同,王龙,周雯雯
(江西农业大学 国土资源与环境学院,江西 南昌 330045)
氨氟乐灵属于二硝基苯胺类选择性芽前土壤封闭除草剂,作用方式为抑制纺锤体的形成,从而抑制细胞分裂和根系、芽的生长[1-3]。主要通过杂草的胚芽和胚轴吸收,对已出土杂草及以根茎繁殖的杂草无效果,持效期长,适用于棉花、大豆、冬小麦和果园等作物一年生禾本科和部分阔叶杂草的防治[4-8]。目前,有关氨氟乐灵原药和制剂有效成分的检测有气相色谱法和液相色谱法[9-10],此类方法虽定量较准确,但检出限较高。本文在优化前人分析方法的基础上,采用HPLC-MS和GC-MS对65%氨氟乐灵水分散粒剂中有效成分检测进行了实验,方法操作方便,检出限低,结果可靠,可用于氨氟乐灵制剂中有效成分的分析。
1.1 试剂与仪器
甲醇、丙酮、乙腈、甲酸、乙酸均为色谱纯;65%氨氟乐灵水分散粒剂;氨氟乐灵(≥97%)标准品LGC DR公司。
Agilent6120单四级杆液质联用仪;Agilent1260高效液相色谱仪;安捷伦气相色谱(7890B)-质谱(5977B)联用仪;EX224ZH电子天平;TST-USB-20超纯水机;0.22 μm有机滤膜。
1.2 仪器条件
1.2.1 HPLC-MS仪器条件
1.2.1.1 液相色谱条件 Zorbax Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),甲醇∶0.2%乙酸水(体积比80∶20)为流动相,流速1 mL/min,柱温箱35 ℃,进样量10 μL。
1.2.1.2 质谱条件 采用ESI离子源负离子扫描SIM模式,SIM模式离子选择349.1(m/z),碰撞诱导解离电压100 V,干燥器温度350 ℃,雾化器压力0.31 MPa,干燥器(氮气)流速12.0 L/min,驻留590 ms,相对驻留100%,增益1.00。
1.2.2 GC-MS仪器条件
1.2.2.1 气相色谱条件 HP-5MS型毛细管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm);氦气作载气,载气流速1.2 mL/min;进样口温度250 ℃。升温程序:初温170 ℃保持1 min,以25 ℃/min速度升温至230 ℃, 再以10 ℃/min速度升温至260 ℃,并保持3 min。采用分流进样的方式,分流比为1∶1,进样量1 μL。
1.2.2.2 质谱条件 定量离子为321,辅助定性离子为279,333,离子化能量70 eV,溶剂延时6 min,质谱接口温度270 ℃,离子源温度230 ℃,四极杆温150 ℃。
1.3 溶液的配制
1.3.1 标样溶液配制 准确称取两份0.01 g氨氟乐灵标准品(精确至0.000 1 g),分别用甲醇和丙酮溶解,超声20 min,冷却至室温。用100 mL容量瓶定容至刻度,配制成100 mg/L甲醇、丙酮标样储备液。
1.3.2 试样溶液配制 准确称取两份0.015 38 g 65%氨氟乐灵水分散粒剂(精确至0.000 1 g),分别用甲醇和丙酮溶解,超声20 min,冷却至室温,用100 mL容量瓶定容至刻度,配制成有效成分为100 mg/L 甲醇、丙酮试样溶液。
1.4 实验方法
1.4.1 HPLC-MS测定 将甲醇标准储备液逐级稀释至0.01,0.05,0.1,0.25,0.5,1 mg/L,用0.22 μm有机滤膜过滤,待HPLC-MS开机后仪器稳定进行测定。
1.4.2 GC-MS测定 将丙酮标准储备液逐级稀释至0.05,0.1,0.25,0.5,1,2 mg/L,用0.22 μm有机滤膜过滤,待GC-MS开机后仪器稳定进行测定。
试样中氨氟乐灵的质量分数W1(%)按下式计算。
式中A1——氨氟乐灵试样响应值;
A2——标样响应值;
M1——氨氟乐灵试样量,mg;
M2——标样质量,mg;
W2——氨氟乐灵标样的质量分数,%。
2.1 溶剂的选择
氨氟乐灵在不同溶剂中的溶解度分别为:丙酮极易溶,乙腈、甲醇和氯仿易溶,正己烷、异戊烷、超纯水微溶。氨氟乐灵标准品用甲醇、乙腈和丙酮作溶剂配制成浓度均为1 mg/L的样品,在GC-MS上进行分析。结果表明,用甲醇作为溶剂时,响应值较小,且基峰较高;丙酮作为溶剂时,响应值高,且峰形好;乙腈作为溶剂时,样品响应值与丙酮接近,但长期使用乙腈,易造成色谱柱固定相流失,降低色谱柱寿命。所以,GC-MS检测采用丙酮作样品溶剂。
HPLC-MS通常优先选用流动相作为样品溶剂,经测试,用甲醇作为溶剂时,响应值较高,且无杂峰,故选用甲醇作流动相。
2.2 HPLC-MS条件选择
2.2.1 色谱条件优化 选择1 mg/L氨氟乐灵标准品溶液对条件进行优化,选用甲醇-水/0.2%乙酸水和乙腈-水/0.2%乙酸水两种流动相对氨氟乐灵进行分离。结果表明,乙腈-水作为流动相时,峰面积较小,且有峰拖尾发生;将超纯水更换为0.2%乙酸水后,峰拖尾情况有所改善,但峰面积依然较小。选用甲醇-水作为流动相时,峰面积较大,但峰型拖尾,而将超纯水更换为0.2%乙酸水后,峰面积增大,且峰型对称,所以确定选用甲醇-0.2%乙酸水作为流动相。
随后对甲醇-0.2%乙酸水流动相比例进行调整,结果表明,体积比为80∶20时,峰型最佳,且保留时间较短。而后调整流速与柱温,在流速1 mL/min、 柱温35 ℃时峰型最好,且峰面积最大。经多次进样,数据并无较大波动,由此确定色谱条件。
图1 HPLC-MS氨氟乐灵标准品色谱图Fig.1 HPLC-MS Standard chromatogram of prodiamine
2.2.2 质谱条件优化 在SCAN模式下,对1 mg/L氨氟乐灵标准品溶液进行ESI离子源(+/-)模式相对分子质量为200～500范围内扫描,得出在负离子模式下可获得强有效峰,且349.1,351.0为主要离子,随后选择SIM模式双通道模式对349.1,351.0进行分析发现,在m/z为349.1时为最强有效峰。随后在SIM模式下对质谱条件进一步优化,调整碰撞诱导解离电压等参数,至样品在仪器条件下响应值达到最大时确定最终质谱条件。
2.3 GC-MS条件选择
2.3.1 离子选择 对100 mg/L氨氟乐灵标准品溶液在相对分子质量为100～700范围内进行全扫描,根据氨氟乐灵质谱图(图2)中丰度最大的离子,以及全扫描结果中丰度最大的离子确定设置定量离子为321,并另外选择两个丰度较大的离子作为辅助定性离子分别为279,333,随后以上述离子进行选择离子监测模式(SIM)对样品进行测定。
图2 氨氟乐灵标准质谱图Fig.2 Standard mass spectrometry of prodiamine
图3 GC-MS氨氟乐灵标准品色谱图Fig.3 GC-MS Standard chromatogram of prodiamine
图4 氨氟乐灵HPLC-MS标准曲线Fig.4 Standard curve of prodiamine in HPLC-MS
图5 氨氟乐灵GC-MS标准曲线Fig.5 Standard curve of prodiamine in GC-MS
2.3.2 升温程序的优化 进样口温度设置为250 ℃,可确保样品完全气化,且在进样口端不会因样品分解造成峰面积减小等问题。初始柱温设置为170 ℃保持1 min,以25 ℃/min升温至230 ℃,再以10 ℃/min 升温至260 ℃保持3 min,期间氨氟乐灵可以与杂质完全分离,缩短了检测时间并提高了检测效率。
2.4 方法线性相关性与检出限
2.4.1 HPLC-MS法标准工作曲线 甲醇标准工作液根据所述条件上机测定,采用外标法定量,横坐标为质量浓度x(mg/L),纵坐标为响应值y,将数据拟合得到线性回归方程:y=657 674x-967.1,R2=1.000 0。根据国家标准,在实际进样时,仪器的信噪比(S/N)等于3时所检测的样品浓度,得出在该仪器条件下的最低检出限(LOD)值为0.002 mg/L。
2.4.2 GC-MS法标准工作曲线 丙酮标准工作液根据所述条件上机检测,用Agilent MassHunter进行分析,以溶液质量浓度(mg/L)为横坐标x,响应值为纵坐标y绘制标准曲线,得出线性回归方程为y=6 448.2x-26.037,R2=0.999 6,在仪器信噪比(S/N)为3时,在该仪器条件下的LOD值为0.005 mg/L。
2.5 方法精密度测定
取氨氟乐灵甲醇、丙酮试样溶液各5份,分别在上述两种仪器条件下进行检测,结果见表1、表2。
表1 HPLC-MS 65%氨氟乐灵水分散粒剂精密度测定Table 1 Precision determination of 65% prodiamine WG in HPLC-MS
表2 GC-MS 65%氨氟乐灵水分散粒剂精密度测定Table 2 Precision determination of 65% prodiamine WG in GC-MS
HPLC-MS方法的标准偏差和变异系数分别是0.23%,0.36% (见表1),GC-MS方法的标准偏差和变异系数分别是0.32%,0.49%(见表2)。
2.6 准确度实验
准确称取10份已知含量65%氨氟乐灵水分散粒剂试样,置于50 mL容量瓶中,各取5份分别加入一定量甲醇标准溶液和丙酮标准溶液,按上述两种方法进行测定,结果见表3、表4。
表3 HPLC-MS 65%氨氟乐灵水分散粒剂准确度测定Table 3 Accuracy of 65% prodiamine WG in HPLC-MS
表4 GC-MS 65%氨氟乐灵水分散粒剂精密度测定Table 4 Accuracy of 65% prodiamine WG in GC-MS
由表可知,HPLC-MS法氨氟乐灵回收率为98.12%～101.35%,平均回收率为99.66%;GC-MS氨氟乐灵回收率为99.77%～101.91%,平均回收率为100.94%。
采用HPLC-MS和GC-MS技术,建立了测定65%氨氟乐灵水分散剂有效成分含量的两种分析方法。与目前已有的气相色谱法和高效液相色谱法比较,检出限更低,且准确度和精密度更高,线性相关性更好,同时具有操作方便、检测时间较短等优点,可作为氨氟乐灵水分散粒剂中有效成分的分析方法。
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