史文倩，赵美英，黄捷，贺桂，汪桂青
慢性脑低灌注（chronic cerebral hypoperfusion，CCH）是阿尔茨海默病、血管性痴呆等认知障碍性疾病的病理基础［1］。CCH 主要是由血容量不足、管腔狭窄等原因引起大脑长期供血不足，造成脑缺血缺氧状态，继而出现持久或进展性的认知障碍［2-3］。微小RNA（miRNA）可通过调控靶基因来调节CCH 相关的病理过程［4-6］。miR-139-5p是一种在大脑中发挥神经保护作用的miRNA，在脑缺血/再灌注小鼠大脑和氧糖剥夺/复氧诱导的皮层神经元损伤模型中下调，上调其表达可减轻神经元损伤［7］。但miR-139-5p 在CCH 中的作用鲜有报道。受体相互作用蛋白激酶（receptor-interacting protein kinase，RIPK）1/RIPK3/混合系列蛋白激酶结构域蛋白（mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL）信号通路与神经细胞的程序性坏死相关［8］。RIPK1是一种由N 末端激酶结构域、中间结构域和C 末端死亡结构域组成的蛋白质，当肿瘤坏死因子-α（TNF-α）结合TNF 受体-1 形成信号复合物时，RIPK1 被募集并发生磷酸化，激活RIPK3和MLKL激酶，使神经细胞发生程序性坏死［9-10］。抑制RIPK1/RIPK3/MLKL 可减轻脑卒中大鼠神经元的坏死样凋亡，改善认知功能［9］。本研究旨在探讨miR-139-5p 靶向RIPK1/RIPK3/MLKL 信号通路对CCH 大鼠认知障碍的影响。
1.1 实验动物与细胞 60只SPF级雄性SD大鼠，6周龄，体质量260～280 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2021-0011。所有大鼠均饲养在SPF 级恒温（22±1）℃、相对湿度50%～60%的通风实验室中，维持12 h/12 h光照黑暗节律，分笼饲养，自由摄食、饮水。适应性饲养1周后用于实验。本实验经我院动物伦理委员会批准（批件号20220017），实验操作符合《实验动物管理条例》相关要求。人胚胎肾细胞株HEK293购自中国科学院上海细胞库，培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，在37 ℃、5%CO2的细胞培养箱环境中培养。
1.2 主要试剂与仪器 miR-NC、miR-139-5p mimic 购自上海吉玛制药有限公司；
RIPK1抑制剂Nec-1、胎牛血清、RPMI 1640培养基购自英国Abcam公司；
戊巴比妥钠购自中国上海信裕生物科技有限公司；
BCA蛋白浓度测定试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；
谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、TNF-α、白细胞介素6（IL-6）酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购自南京建成生物工程研究所；
RNA 提取试剂盒、反转录试剂盒购自Invitrogen 公司；
兔源RIPK1、RIPK3、MLKL、突触前膜和突触后膜关键蛋白突触素（synapsin，SYP）、突触后密度蛋白95（postsynapticdensity protein 95，PSD95）、α-突触核蛋白（α-synuclein，α-SYN）一抗和山羊抗兔IgG二抗购自美国Sigma-Aldrich 公司。Morris水迷宫购自中国医学科学院药物研究所。
1.3 方法
1.3.1 大鼠CCH模型建立 采用随机数字表法抽取12只大鼠为假手术组（Sham 组），余48只大鼠建立CCH 模型。参照文献［10］，永久性结扎双侧颈总动脉（two vessel occlusion，2VO）构建大鼠CCH 模型。术前所有大鼠禁食12 h，禁水4 h。采用3%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠。将麻醉后大鼠仰卧固定在手术台上，颈前皮肤去毛，消毒后于颈部正中行1 cm切口，分离双侧颈动脉，结扎一侧颈总动脉，30 min后结扎对侧颈总动脉，注意保持大鼠体温恒定。缝合皮肤，消毒，等待大鼠苏醒。
1.3.2 动物分组与给药 采用随机数字表法将造模大鼠分为模型组（Model 组）、miR-NC 组、miR-139-5p mimic 组、miR-139-5p mimic+RIPK1 抑制剂Nec-1 组（miR-139-5p mimic+Nec-1 组），每组12 只。造模成功第2 天，miR-NC 组大鼠于侧脑室注射miR-NC（0.8 nmol miR-NC 溶于4 μL PBS中［7］），miR-139-5p mimic 组大鼠于侧脑室注射同剂量的miR-139-5p mimic，miR-139-5p mimic+Nec-1组大鼠于侧脑室注射同剂量的miR-139-5p mimic 和Nec-1（10 μmol/L Nec-1 10 μL［11］）。侧脑室注射方法：麻醉大鼠后固定，沿中线进行头皮切口，并在颅骨右侧钻一个毛刺孔，使用微量注射器分别将上述试剂注射到右侧脑室中。注射5 min后再取出针头，用骨蜡密封毛刺孔，待大鼠苏醒。Sham组只行开关颈部的操作，不结扎颈总动脉，与Model组侧脑室注射等量的生理盐水。
1.3.3 新物体识别实验 造模4周后，准备一个无盖的白色塑料盒，以及颜色、大小、形状均不相同的两套物体。首先对各组大鼠进行适应性训练。在盒子一侧2个角落放置完全相同的2个物体，把大鼠面向对侧盒壁放入盒子中，使其在盒子中自由活动15 min，每放入1只大鼠前对盒内进行乙醇消毒，消除盒子气味。实验过程中保持参照物不移动，且环境安静。次日进行物体再认实验。将第1天放入的其中一个物体更换为颜色、大小、形状均不同的新物体，按相同的方法放入大鼠，分别记录5 min内大鼠对新物体和旧物体的探索时间。计算分辨系数，分辨系数=（探索新物体时间-探索旧物体时间）/探索总时间。
1.3.4 Morris 水迷宫实验 新物体识别实验后，进行Morris水迷宫实验。定位航行实验：每日于东、南、西、北4个定点放入大鼠，使大鼠头朝向水池壁放入水中。记录大鼠找到平台的时间，并使其在平台上停留15 s，如果60 s内未成功找到平台，则引导大鼠找到平台。实验期间保持环境安静且参照物不变。重复5 d，记录大鼠找到平台所用的时间，即逃逸潜伏期。空间探索实验：在第6天撤去平台，于原平台位置的对侧象限面向水池壁放入大鼠，记录60 s内大鼠在平台所在象限活动的时间。
1.3.5 ELISA 检测大鼠海马组织GSH-Px、SOD、MDA、TNF-α、IL-6水平 水迷宫实验后，脱颈处死所有大鼠，断头取脑，分离海马组织，放入液氮速冻后置于-80 ℃超低温冰箱中保存。根据GSH-Px、SOD、MDA、TNF-α、IL-6 ELISA 试剂盒说明书，检测海马组织GSH-Px、SOD、MDA、TNF-α、IL-6水平。
1.3.6 实时荧光定量PCR（qPCR）法检测大鼠海马组织miR-139-5p 及RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA 表达水平 取冻存的海马组织，根据RNA提取试剂盒说明书，提取大鼠海马组织总RNA，并将RNA反转录为cDNA。以U6、β-actin为内参进行PCR 扩增反应。反应体系（20 μL）：10 μL SYBR®Premix Ex Taq（2×）、0.8 μL PCR正向引物（10 μmol/L）、0.8 μL PCR 反向引物（10 μmol/L）、2 μL cDNA（200 μg/L）和6.4 μL无菌水。反应条件：95 ℃预变性30 s；
95 ℃变性5 s，60 ℃退火20 s，循环40次。引物序列见表1，引物由中国上海GenePharma构建合成。应用2-ΔΔCt法计算miR-139-5p 及RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA的相对表达水平。
Tab.1 Primer design sequence表1 引物设计序列
1.3.7 Western blot 检测大鼠海马组织RIPK1、RIPK3、MLKL、SYP、PSD95、α-SYN 的表达 取冻存的大鼠海马组织，加入RIPA 蛋白裂解液提取组织总蛋白。经BCA 蛋白试剂盒测定蛋白浓度，SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白质，转PVDF 膜，清洗并用脱脂奶粉封闭。用兔源RIPK1（1∶500）、RIPK3（1∶1 000）、MLKL（1∶1 000）、SYP（1∶1 000）、PSD95（1∶1 000）、α-SYN（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）一抗于4 ℃下孵育过夜。次日复温洗膜后，加入山羊抗兔IgG二抗（1∶5 000）室温孵育2 h，加入ECL 试剂进行显影，利用Image Lab 软件对目标蛋白的灰度值进行计算分析。
1.3.8 双萤光素酶基因报告实验验证靶向关系 使用TargetScan 数据库进行miR-139-5p 和RIPK1 之间的结合位点预测。由上海GenePharma 公司构建RIPK1 野生型质粒（RIPK1-WT）和突变型质粒（RIPK1-MUT），将HEK293 细胞以1×105个/孔接种在24 孔板中。用Lipofectamine2000 将RIPK1-WT 和RIPK1-MUT 分别与miR-NC 或miR-139-5p mimic共转染于HEK293细胞中。48 h后，应用荧光测定仪检测萤光素酶活性。
1.4 统计学方法 采用GraphPad Prism7.0 软件进行数据分析。计量资料采用表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。
2.1 各组大鼠新物体识别能力比较 Sham 组、Model 组、miR-NC 组、miR-139-5p mimic 组和miR-139-5p mimic+Nec-1 组分辨系数分别为0.42±0.06、0.16±0.02、0.15±0.01、0.24±0.04和0.38±0.06，其差异有统计学意义（n=12，F=100.000，P＜0.01）。与Sham 组相比，Model 组大鼠分辨系数降低（P＜0.05）；
与Model 组、miR-NC 组相比，miR-139-5p mimic组大鼠分辨系数升高（P＜0.05）；
与miR-139-5p mimic 组相比，miR-139-5p mimic+Nec-1 组大鼠分辨系数升高（P＜0.05）。
2.2 各组大鼠定位航行实验逃避潜伏期比较 与Sham 组相比，Model 组大鼠逃避潜伏期延长（P＜0.05）；
与Model 组、miR-NC 组相比，miR-139-5p mimic 组大鼠逃避潜伏期缩短（P＜0.05）；
与miR-139-5p mimic 组相比，miR-139-5p mimic+Nec-1 组大鼠逃避潜伏期缩短（P＜0.05），见表2。
Tab.2 Comparison of escape latency in Morris water maze positioning navigation experiment between the five groups of rats表2 各组大鼠Morris水迷宫定位航行实验逃避潜伏期比较（n=12，s，）
Tab.2 Comparison of escape latency in Morris water maze positioning navigation experiment between the five groups of rats表2 各组大鼠Morris水迷宫定位航行实验逃避潜伏期比较（n=12，s，）
＊＊P＜0.01；
a与Sham组比较，b与Model组比较，c与miR-NC组比较，d与miR-139-5p mimic组比较，P＜0.05；
表3—5同。
组别Sham组Model组miR-NC组miR-139-5p mimic组miR-139-5p mimic+Nec-1组F 1 d 30.28±3.75 53.65±5.02a 53.23±4.86 42.36±3.25bc 33.55±2.38d 88.897＊＊2 d 26.62±3.37 50.40±4.16a 50.06±4.22 37.14±3.54bc 28.10±1.95d 125.718＊＊3 d 24.39±2.72 48.45±4.21a 48.64±4.26 33.71±2.92bc 25.55±1.67d 154.959＊＊4 d 20.38±2.30 45.32±3.85a 45.53±4.08 29.42±2.39bc 22.83±1.23d 199.106＊＊5 d 16.60±1.87 41.06±3.77a 41.65±3.51 25.37±2.14bc 18.62±1.15d 241.944＊＊
2.3 各组大鼠空间探索实验目标象限停留时间比较 Sham 组、Model 组、miR-NC 组、miR-139-5p mimic组和miR-139-5p mimic+Nec-1组目标象限停留时间（s）分别为27.87±2.37、10.48±1.25、9.89±1.04、18.28±2.20 和25.44±3.42，差异有统计学意义（n=12，F=165.987，P＜0.01）。与Sham 组相比，Model 组大鼠目标象限停留时间缩短（P＜0.05）；
与Model 组、miR-NC 组相比，miR-139-5p mimic 组大鼠目标象限停留时间延长（P＜0.05）；
与miR-139-5p mimic 组相比，miR-139-5p mimic+Nec-1 组大鼠目标象限停留时间延长（P＜0.05）。
2.4 各组大鼠海马组织GSH-Px、SOD、MDA、TNF-α、IL-6 水平比较 见表3。与Sham 组相比，Model组大鼠GSH-Px、SOD 水平降低，MDA、TNF-α、IL-6水平升高（P＜0.05）；
与Model 组、miR-NC 组相比，miR-139-5p mimic 组大鼠GSH-Px、SOD 水平升高，MDA、TNF-α、IL-6 水平降低（P＜0.05）；
与miR-139-5p mimic 组相比，miR-139-5p mimic+Nec-1 组大鼠GSH-Px、SOD 水平升高，MDA、TNF-α、IL-6 水平降低（P＜0.05）。
Tab.3 Comparison of GSH-Px,SOD,MDA,TNF-α and IL-6 levels in hippocampus between the five groups of rats表3 各组大鼠海马组织GSH-Px、SOD、MDA、TNF-α、IL-6水平比较（n=6，）
Tab.3 Comparison of GSH-Px,SOD,MDA,TNF-α and IL-6 levels in hippocampus between the five groups of rats表3 各组大鼠海马组织GSH-Px、SOD、MDA、TNF-α、IL-6水平比较（n=6，）
组别Sham组Model组miR-NC组miR-139-5p mimic组miR-139-5p mimic+Nec-1组F GSH-Px/（kU/g）28.04±3.36 8.67±0.95a 8.96±0.78 16.83±1.22bc 27.74±2.30d 140.124＊＊SOD/（kU/g）50.47±2.63 12.24±0.88a 11.82±0.95 26.41±2.38bc 43.10±3.59d 343.236＊＊MDA/（mmol/g）0.78±0.08 3.24±0.25a 3.12±0.21 1.18±0.09bc 0.80±0.03d 383.479＊＊TNF-α/（ng/L）95.15±9.24 316.42±26.32a 309.48±27.26 248.37±25.40bc 176.45±16.34d 108.404＊＊IL-6/（ng/L）12.53±1.14 58.63±6.05a 57.03±5.76 30.28±2.51bc 16.49±1.73d 178.559＊＊
2.5 各组大鼠miR-139-5p、RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA 水平比较 与Sham 组相比，Model 组大鼠miR-139-5p 水平降低，RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA水平升高（P＜0.05）；
与Model 组、miR-NC 组相比，miR-139-5p mimic 组大鼠miR-139-5p 水平升高，RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA水平降低（P＜0.05）；
与miR-139-5p mimic 组相比，miR-139-5p mimic+Nec-1组大鼠miR-139-5p水平差异无统计学意义，RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA 水平降低（P＜0.05），见表4。
Tab.4 Comparison of miR-139-5p,RIPK1,RIPK3 and MLKL mRNA levels between the five groups of rats表4 各组大鼠miR-139-5p及RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA水平比较（n=6，）
Tab.4 Comparison of miR-139-5p,RIPK1,RIPK3 and MLKL mRNA levels between the five groups of rats表4 各组大鼠miR-139-5p及RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA水平比较（n=6，）
组别Sham组Model组miR-NC组miR-139-5p mimic组miR-139-5p mimic+Nec-1组F miR-139-5p 1.00±0.00 0.31±0.03a 0.30±0.03 0.66±0.08bc RIPK1 1.00±0.00 2.24±0.20a 2.20±0.21 1.64±0.13bc RIPK3 1.00±0.00 1.97±0.18a 1.95±0.19 1.58±0.09bc MLKL 1.00±0.00 2.16±0.20a 2.12±0.21 1.65±0.10bc 0.89±0.091.15±0.06d 1.23±0.03d 1.28±0.04d 191.724＊＊94.870＊＊71.818＊＊81.511＊＊
2.6 各组大鼠RIPK1/RIPK3/MLKL信号通路相关蛋白与SYP、PSD95、α-SYN 蛋白表达比较 与Sham组相比，Model 组大鼠RIPK1、RIPK3、MLKL、α-SYN蛋白表达升高，SYP、PSD95蛋白表达水平降低（P＜0.05）；
与Model 组、miR-NC 组相比，miR-139-5p mimic 组大鼠RIPK1、RIPK3、MLKL、α-SYN 蛋白表达水平降低，SYP、PSD95 蛋白表达水平升高（P＜0.05）；
与miR-139-5p mimic 组相比，miR-139-5p mimic+Nec-1 组大鼠RIPK1、RIPK3、MLKL、α-SYN蛋白表达水平降低，SYP、PSD95 蛋白表达水平升高（P＜0.05），见表5、图1。
Fig.1 The expression of related proteins detected by Western blot assay图1 Western Blot检测相关蛋白表达
Tab.5 Comparison of RIPK1/RIPK3/MLKL signaling path-related proteins and SYP,PSD95 and α-SYN protein expression levels between the five groups of rats表5 各组大鼠RIPK1/RIPK3/MLKL信号通路相关蛋白与SYP、PSD95、α-SYN蛋白表达比较 （n=6，）
Tab.5 Comparison of RIPK1/RIPK3/MLKL signaling path-related proteins and SYP,PSD95 and α-SYN protein expression levels between the five groups of rats表5 各组大鼠RIPK1/RIPK3/MLKL信号通路相关蛋白与SYP、PSD95、α-SYN蛋白表达比较 （n=6，）
组别Sham组Model组miR-NC组miR-139-5p mimic组miR-139-5p mimic+Nec-1组F RIPK1 0.21±0.02 0.86±0.08a 0.83±0.08 0.55±0.03bc 0.38±0.02d 164.338＊＊RIPK3 0.24±0.02 0.90±0.09a 0.92±0.08 0.41±0.04bc 0.29±0.02d 196.456＊＊MLKL 0.17±0.02 0.81±0.08a 0.79±0.08 0.48±0.03bc 0.23±0.01d 191.366＊＊SYP 0.87±0.08 0.23±0.02a 0.21±0.02 0.56±0.05bc 0.75±0.08d 166.360＊＊PSD95 0.82±0.08 0.19±0.02a 0.18±0.02 0.42±0.06bc 0.80±0.08d 188.145＊＊α-SYN 0.15±0.02 0.76±0.07a 0.77±0.07 0.38±0.03bc 0.20±0.02d 232.096＊＊
2.7 双萤光素酶基因报告实验 预测得到的miR-139-5p 和RIPK1 之间的结合位点见图2。与RIPK1-WT 共转染后，miR-139-5p mimic 组萤光素酶活性较miR-NC 组降低（0.28±0.03vs. 1.17±0.06，n=3，t=22.980，P＜0.05）；
与RIPK1-MUT 共转染后，miR-139-5p mimic 组与miR-NC 组萤光素酶活性差异无统计学意义（1.14±0.05vs. 1.10±0.09，n=3，t=0.673，P＞0.05）。
Fig.2 Binding sites of miR-139-5p and RIPK1图2 miR-139-5p和RIPK1的结合位点
CCH 可以导致神经元变性和认知障碍，CCH 后认知障碍与沉默突触增多、线粒体老化、α-SYN 表达增加有关［12-14］。SYP是位于突触前膜囊泡内的钙结合膜蛋白，可将神经元接受到的外界信号所产生的电信号转化为化学信号，突触小泡移动至突触前膜，与其融合后释放神经递质，参与突触的连接；
而突触连接是认知功能的神经生物学基础，突触连接丧失或功能异常将会导致严重的认知障碍［15］。因此，SYP 表达水平能有效反映突触的结构和功能状态，与认知功能密切相关［16］。PSD95 是突触后膜的标志性蛋白，能接受突触信号并将其整合传递至突触后细胞，同时作为一种神经细胞骨架蛋白，在突触功能活性和突触信息传导中发挥重要作用［17］。研究显示，SYP 和PSD95 表达水平在认知缺陷模型和CCH 大鼠中降低，上调SYP 和PSD95 表达可改善认知功能［18-19］。α-SYN 大量存在于神经细胞中，在突触间信息传递、突触可塑性等神经功能中起到重要作用。研究发现，α-SYN 的异常聚集会损害突触，可以通过减少突触蛋白表达、激活钙调磷酸酶等机制影响突触功能，并通过炎症、细胞凋亡、氧化应激等机制介导神经元死亡，导致神经传递功能障碍，与认知功能密切相关［20-21］。研究显示，在大鼠的黑质内输注α-SYN低聚物会诱发神经炎症，导致认知障碍［22］。本研究通过2VO法建立大鼠CCH模型，结果发现，与Sham 组相比，Model 组大鼠分辨系数、目标象限停留时间、GSH-Px、SOD水平、SYP、PSD95蛋白表达水平显著下降，逃避潜伏期、MDA水平、α-SYN蛋白表达水平显著上升，说明大鼠CCH 模型建立成功。
miRNA 在中枢神经系统中广泛表达，且作为多种细胞生物学过程的关键调节因子［23］。Wang 等［24］研究发现，上调miR-139-5p 可以负调节c-Jun/NLRP3 炎症小体信号传导，对氧-葡萄糖剥夺/复氧诱导的神经损伤发挥神经保护作用。Yao 等［7］研究发现人参皂苷Rd 通过上调miR-139-5p 抑制FOXO1，随后激活Nrf2 抗氧化途径，减轻缺血性卒中。本研究中，与Model 组、miR-NC 组相比，miR-139-5p mimic 组大鼠miR-139-5p 水平、分辨系数、目标象限停留时间、GSH-Px、SOD水平、SYP、PSD95蛋白表达上升，逃避潜伏期、海马组织MDA水平、α-SYN蛋白表达下降，说明上调miR-139-5p可能减轻CCH大鼠的认知障碍。
RIPK1 的激活能够启动细胞RIPK3/MLKL 依赖性坏死和细胞FADD/caspase-8依赖性凋亡［8］。研究发现，短暂性脑缺血可以显著激活RIPK1激酶，进而激活RIPK3 和MLKL 激酶，使神经细胞发生程序性坏死；
而Nec-1 能够通过抑制缺血性卒中后大鼠脑中RIPK1介导的RIPK3/MLKL 依赖性坏死性凋亡来防止缺血性神经元死亡［8］，与本研究结果一致。本研究结果显示，与Sham组相比，Model组大鼠海马组织RIPK1、RIPK3、MLKL 的mRNA 和蛋白表达上升，说明CCH 状态下，RIPK1/RIPK3/MLKL 信号通路被激活。与Model 组、miR-NC 组相比，miR-139-5p mimic 组大鼠RIPK1、RIPK3、MLKL 的mRNA 和蛋白表达下降，且双萤光素酶实验证实miR-139-5p可靶向调节RIPK1表达，说明上调miR-139-5p可能通过靶向抑制RIPK1/RIPK3/MLKL信号通路减轻CCH大鼠的认知障碍。为了验证此猜想，笔者用RIPK1 抑制剂Nec-1 来干预miR-139-5p mimic 组大鼠，结果发现，Nec-1促进了上调miR-139-5p对CCH大鼠认知功能的恢复。
综上所述，上调miR-139-5p可能通过靶向抑制RIPK1/RIPK3/MLKL信号通路减轻CCH大鼠的认知障碍。然而，本研究还仅在体内水平上进行了探究，后续需在体外水平进一步验证该靶点作用。
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