谭智杰，张巧毅，赵柔，王常贵，林元山,*
茯苓菌液体发酵产胞内多糖条件的优化
谭智杰1，张巧毅2，赵柔2，王常贵2，林元山1,2*
(1.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 410128；
2.农业生物工程研究所，湖南 长沙 410128)
以不同碳源、氮源、pH、温度、接种量、转速、时间为单一变量，通过单因素试验和Plackett–Burman试验从7个因素中筛选显著性因素，对筛选出的显著性因素进行最陡爬坡试验，采用Box–Behnken试验探究茯苓菌液体发酵产胞内多糖的最优条件。结果表明：接种量、pH、葡萄糖质量分数和酵母膏质量分数是茯苓菌液体发酵产胞内多糖的显著性因素；
在接种量9%、pH 5.7、葡萄糖质量分数4%、酵母膏质量分数1%、时间7 d、温度28 ℃、转速170 r/min的条件下，茯苓胞内多糖的含量为(5.82±0.18) g/L，生物量为(14.63±0.21) g/L，分别为未优化前的1.6倍和2.0倍。与常规栽培相比，茯苓菌液体发酵产胞内多糖的时间大大缩短，减少了松材消耗，且茯苓菌液体发酵培养基成本低廉。
茯苓；
液体发酵；
胞内多糖；
Plackett–Burman试验；
Box–Behnken试验
茯苓(PORIA)为多孔菌科真菌茯苓((Schw.)Wolf)的干燥菌核，其性甘、淡、平[1]。茯苓中富含多种化学成分[2]，如三萜[3]、多糖和甾醇[4]等。茯苓多糖具有护肝[5–6]、诱导凋亡[7]、抗肿瘤、抗氧化[8–9]、利尿[10]、强化巨噬细胞的吞噬功能[11–12]等。茯苓的生产现主要依靠人工栽培，需耗费大量松材，种植周期近一年或更长，且管理要求高、效益低[13]。相比于传统的人工种植，茯苓菌种液体发酵无需砍伐木材，具有发酵周期短、过程可控等优点，可为解决茯苓人工栽培与林地生态的矛盾提供新的思路。本研究中，探讨了茯苓菌液体发酵高产胞内多糖的条件，旨在为规模化生产茯苓多糖提供依据。
1.1 材料
茯苓菌株由湖南农业大学农业生物工程研究所筛选；
98%浓硫酸、苯酚、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B1等均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1培养基及种子液的制备
斜面及平板培养基的制备：将PDA培养基置于28 ℃恒温培养箱培养7 d。
种子液培养基的制备：准确称取葡萄糖20 g、蛋白胨5 g、磷酸二氢钾1 g、硫酸镁0.75 g溶于1000 mL蒸馏水中。
摇瓶发酵液体培养基的制备：准确称取葡萄糖30 g、蛋白胨5 g、磷酸二氢钾1 g、硫酸镁0.75 g、维生素B10.05 g溶于1000 mL蒸馏水中。
种子液的制备：将100 mL种子液培养基装入250 mL三角瓶中，121 ℃灭菌25 min后冷却至室温，用接种环挑取斜面茯苓菌丝体，接入种子培养基中，26 ℃培养4 d，作为液体菌种备用。
初始摇瓶发酵液的制备：将100 mL摇瓶发酵液体培养基装入250 mL三角瓶中，按4%比例接种种子液，初始pH 5.5，于150 r/min、26 ℃摇床培养箱中培养7 d。
1.2.2菌体量及胞内多糖含量的测定
菌体量的测定：将发酵液抽滤后用蒸馏水清洗菌丝体，3次重复，再将菌丝体放入60 ℃烘箱中烘干至恒重，称取菌丝体的干质量。
胞内多糖的测定：发酵液4000 r/min离心15 min，弃上清，蒸馏水清洗菌丝体3次，将菌丝体置于60 ℃烘箱烘干，取0.1 g菌丝体，加入5 mL 0.5 mol/L NaOH，细胞破碎仪破碎5 min，4000 r/min离心5 min后取上清，2次重复，合并液体。以葡萄糖为标样，采用苯酚–硫酸法[14]测定多糖含量，参考周跃斌等[15]的方法制作标准曲线。
1.2.3茯苓菌多糖液体发酵的单因素试验
以不同碳源(果糖、蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、乳糖)、氮源(酵母粉、酵母膏、蛋白胨、牛肉浸膏、豆浆)、时间(3、4、5、6、7、8 d)、温度(22、24、26、28、30 ℃)、pH(3、4、5、6、7、8)、接种量(2%、4%、6%、8%、10%)、转速(140、150、160、170、180 r/min)为单一变量，依次进行茯苓菌液体发酵，按照1.2.2中的方法测定茯苓菌丝体干质量和胞内多糖的含量。
1.2.4Plackett-Burman试验筛选茯苓多糖的显著因素
在单因素试验的基础上，以胞内多糖作为响应值，对接种量(1)、温度(2)、时间(3)、酵母膏质量分数(4)、转速(5)、pH(6)、葡萄糖质量分数(7)等7个因素进行评价，筛选出显著性因素。每个因素取最低(–1)和最高(1)水平，共12组试验，试验因素及其水平如表1所示。
表1 Plackett–Burman试验设计的因素及水平
1.2.5最陡爬坡试验
根据Plackett–Burman试验结果选取显著性因素进行最陡爬坡试验。
1.2.6响应面法优化试验设计
根据Plackett–Burman试验设计及最陡爬坡试验进行Box–Behnken试验设计，根据试验结果建立数学回归模型并进行分析。
1.2.7数据处理
采用SPSS 21和Excel 2019进行数据处理；
采用Origin 2021进行绘图。
2.1 单因素试验结果
从图1可知：在不同碳源(图1–Ⅰ)中，葡萄糖为最优碳源，其生物量和胞内多糖含量分别达到8.31g/L和2.44 g/L；
在不同氮源(图1–Ⅱ)中，酵母膏为最优氮源，其生物量和胞内多糖含量分别达到8.36 g/L和2.73 g/L；
图1–Ⅲ表明，当发酵时间在3～7 d内，生物量和胞内多糖随着发酵时间的延长而增加，当发酵时间为7 d时，生物量和胞内多糖含量分别达到7.83、2.26 g/L，第8天略有下降；
图1–Ⅳ表明，26～30 ℃茯苓菌生长状态良好，处理间的生物量和胞内多糖含量差异不显著(>0.05)，其中28 ℃时最优；
图1–Ⅴ表明，培养基在pH 3～6范围内，生物量和胞内多糖含量较高，说明茯苓菌适合在偏酸性培养基上生长，pH为6时最优，生物量和胞内多糖含量分别达到8.48、2.73 g/L；
图1–Ⅵ表明，当接种量为2%～8%时，生物量和多糖含量随着接种量的增加而增加，当接种量为8%时达到最优，分别达到8.77、2.68 g/L，当接种量为10%时，生物量和多糖含量下降；
图1–Ⅶ表明，摇床转速为170 r/min时，生物量和胞内多糖含量达到最优，分别达到7.65、2.04 g/L。
不同大写字母示处理间生物量的差异有统计学意义(P<0.05)；
不同小写字母示处理间胞内多糖含量的差异有统计学意义(P<0.05)。
2.2 显著性因素的确定
表2为Plackett–Burman试验设计以及以胞内多糖作为响应值的结果。用Design–Expert12对表2进行多元回归分析得到表3。由表3可知，该回归分析模型的值<0.05，具有显著性，表明此模型可靠。根据效应值大小可以得知接种量(1)、pH(6)、酵母膏质量分数(4)、葡萄糖质量分数(7)、温度(2)、转速(5)、时间(3)对茯苓菌液体发酵产胞内多糖的影响依次降低。其中：接种量(1)、pH(6)、酵母膏质量分数(4)、葡萄糖质量分数(7)的值<0.05，达到显著水平，说明接种量、pH、酵母膏质量分数、葡萄糖质量分数是影响茯苓菌液体发酵产胞内多糖的显著性因素；
而温度(2)、转速(5)、时间(3)的值>0.05，说明温度、转速、时间对茯苓菌液体发酵产胞内多糖的影响不显著：因此，后续选择接种量、pH、酵母膏质量分数、葡萄糖质量分数4个显著性因素进行响应面试验设计。
表2 Plackett–Burman试验设计及响应值
表3 Plackett–Burman试验因素的效应
“*”“**”分别表示在0.05、0.01水平有统计学意义。
2.3 最陡爬坡试验
根据Plackett–Burman试验结果选取葡萄糖质量分数、酵母膏质量分数、接种量、pH 等4个显著性因子进行最陡爬坡试验。试验结果(表4)表明，最陡爬坡试验中第4组胞内多糖含量最大，所以选择第4组作为响应面设计的中心水平进行后续的Box–Behnken试验设计。
表4 最陡爬坡试验设计及结果
2.4 响应面优化
根据Plackett–Burman试验设计及最陡爬坡试验结果，选取葡萄糖质量分数(1)、接种量(2)、酵母膏质量分数(3)、pH(4)等4个显著性因子进行4因素3水平的Box–Behnken试验设计(表5)，试验结果如表6所示。
表5 Box–Behnken试验的因素及水平
其他发酵条件分别为时间7 d、温度28 ℃、转速170 r/min。
表6 Box–Behnken试验设计及结果
利用Design–Expert12对表6中的试验数据进行拟合回归，得到茯苓菌液体发酵产胞内多糖()对葡萄糖质量分数(1)、接种量(2)、酵母膏质量分数(3)、pH(4)的回归方程：
=5.46+0.117 51+0.735 52+0.218 33+
0.452 54–0.075 012+0.040 013+0.182 514+
0.117 523+0.207 524+0.082 534–
0.722 612–0.618 822–0.406 332–1.2142。
表7结果显示此模型<0.000 1，极显著；
失拟项值(0.377 5)>0.05，不显著，说明该回归模型可靠。在此回归模型中，一次项3对茯苓菌液体发酵产胞内多糖的影响达到显著水平(<0.05)；
而2、4、12、22、32、42对茯苓菌液体发酵产胞内多糖的影响达到极显著水平(<0.01)。由Design–Expert12软件对回归模型进行优化分析，得到茯苓菌液体发酵产胞内多糖的最优条件为：接种量9.37%，pH为5.76，酵母膏质量分数1.1%，葡萄糖质量分数4.09%。在此条件下，软件预测茯苓菌液体培养产胞内多糖的最大理论值为5.82 g/L。结合实际发酵情况，调整茯苓菌液体培养产胞内多糖的最优条件：接种量9%、pH 5.7、酵母膏质量分数1%、葡萄糖质量分数4%、时间7 d、温度28 ℃、转速170 r/min，生物量和胞内多糖含量分别为(14.63±0.21)、(5.82±0.18) g/L，分别达到未优化前的1.6倍和2.0倍，其中，产胞内多糖含量与二次回归方程预测值5.84 g/L基本吻合。
表7 回归模型方差分析结果
“*”“**”分别表示0.05、0.01水平差异有统计学意义。
茯苓适宜栽培于海拔高度 600～1000 m的松林地，以背风向阳、坡度10°～35°、pH 5～6的沙质壤土为宜，栽培时间长，传统菌体栽培需要8～10个月，即使是最快、最先进的嫁接栽培也需要3～4个月，而且茯苓栽培离不开松材[16]，这与国家绿色环保经济策略不相适应：因此，茯苓多糖发酵法在绿色生产中具有重大意义。本研究中，在接种量9%、pH 5.7、葡萄糖质量分数4%、酵母膏质量分数1%、时间7 d、温度28 ℃、转速170 r/min的条件下，茯苓菌可以短时间(7 d)内完成多糖发酵，且培养基配方简单(仅含1%酵母膏、4%葡萄糖)，可以避免松材消耗。另外，在液体发酵过程中，转速170 r/min，只需通入少量无菌空气，成本可控，工业化生产成本进一步压缩。从液体发酵产胞内多糖的水平来看，本研究采用单批发酵法，菌丝体生物量达(14.63±0.21) g/L，与李羿等[17]补料发酵的菌丝体含量14.85 g/L接近；
茯苓胞内多糖含量为(5.82±0.18) g/L，优于李羿等[18]摇瓶液体发酵的胞内多糖含量(3.62 g/L)。本研究结果可为茯苓菌液体发酵产胞内多糖的规模生产提供参考。
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Optimization of liquid fermentation conditions ofto produce intracellular polysaccharide
TAN Zhijie1，ZHANG Qiaoyi2，ZHAO Rou2，WANG Changgui2，LIN Yuanshan1,2*
(1.College of Biological Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan 410128, China; 2.Agricultural Bioengineering Research Institute, Changsha, Hunan 410128, China)
In this study, four significant factors of seven were checked by one-way test and Plackett-Burman test using different carbon and nitrogen sources, pH, temperature, inoculum, rotational speed, and time as single variables. And the steepest-climbing test was carried out on the screened factors. The Box-Behnken test was used to investigate the optimal conditions for intracellular polysaccharide production by liquid fermentation of. The results showed that inoculum, pH, glucose mass fraction and yeast paste mass fraction were the key factors for the production of intracellular polysaccharides by liquid fermentation ofbacteria. The content of intracellular polysaccharides inunder the conditions of inoculum of 9%, pH 5.7, glucose mass fraction of 4%, yeast paste mass fraction of 1%, time of 7 d, temperature of 28 ℃ and rotational speed of 170 r/min. Intracellular polysaccharide was(5.82±0.18) g/L and biomass was (14.63±0.21) g/L, which were 1.6 and 2.0 times higher than those before optimization, respectively. Compared with conventional cultivation, the time for intracellular polysaccharide production by liquid fermentation ofwas greatly shortened, the consumption of pinewood was reduced, and the cost ofliquid fermentation medium was inexpensive.
(Schw.)Wolf; liquid fermentation; intracellular polysaccharide; Plackett-Burman experiment; Box-Behnken experiment
S567.3+2；
R282.71
A
1007–1032(2023)05–0543–06
谭智杰，张巧毅，赵柔，王常贵，林元山．茯苓菌液体发酵产胞内多糖条件的优化[J]．湖南农业大学学报(自然科学版)，2023，49(5)：543–548．
TAN Z J，ZHANG Q Y，ZHAO R，WANG C G，LIN Y S．Optimization of liquid fermentation conditions ofto produce intracellular polysaccharide[J]．Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences)，2023，49(5)：543–548．
http://xb.hunau.edu.cn
2023–02–25
2023–10–11
湖南省高校创新平台开放项目(19K045)；
湖南省重点研发计划项目(2016NK2114)
谭智杰(1996—)，男，湖南凤凰人，硕士研究生，主要从事真菌多糖功能研究，tzj1349124876@163.com；
*通信作者，林元山，博士，副教授，主要从事微生物代谢发酵调控的开发利用研究，wallslin@126.com
10.13331/j.cnki.jhau.2023.05.007
责任编辑：毛友纯
英文编辑：柳正
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