潘 凡，朱凯辉，涂雄兵，张泽华
（中国农业科学院植物保护研究所/植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193）
苜蓿斑蚜TherioaphistrifoliiMonel 作为紫花苜蓿MedicagosativaL.的主要害虫之一，具有世代重叠、繁殖速度快、对环境适应性强等特点[1,2]。其通过口器刺吸汁液，不仅可造成苜蓿发育不良，而且会传播大量的植物病毒，其唾液对植物的防御反应还会起到抑制作用[3]。苜蓿斑蚜的防治一直依赖于化学农药，但是长期使用化学农药带来的环境污染、抗药性等问题也不容忽视[4,5]。相较于化学农药，生物农药具有低毒、无污染、对非靶标生物安全等特点，生物农药的开发和利用逐渐在害虫防治领域中起到了不可替代的作用[6,7]。因此，筛选对苜蓿斑蚜起控制作用的生物农药对苜蓿斑蚜的防控具有重要意义。
植物源杀虫剂作为生物农药的重要一类，可通过植物化学信号引诱、忌避、毒杀、拒食等方式起作用[8,9]。十字花科植物作为小菜蛾PlutellaxylostellaL.的主要寄主，被小菜蛾为害后，其释放的挥发物可引诱菜粉蝶绒茧蜂Apantelesglomeratus[10]。从黄杜鹃花Rhododendronmolle中分离出来的四环二萜化合物对甜菜夜蛾Amaranthusmangostanus、马铃薯甲虫Leptinotarsadecemlineata等具有强烈的拒食、毒杀及生长发育抑制作用[11]。苯并噁嗪类化合物是一类广泛存在于禾本科植物中的次生代谢产物，与植物抗虫性密切相关。该类物质以丁布为代表，目前关于丁布抗虫活性的研究主要集中于欧洲玉米螟OstrinianubilalisHübner、玉米蚜RhopalosiphummaidisFitch、禾谷缢管蚜RhopalosiphumpadiL.、麦无网蚜Metopolophium dirhodumWalker、麦长管蚜SitobionavenaeF.等[12]。许多文献表明，丁布对昆虫具有拒食效应，通过影响昆虫体内酶的活性对昆虫生长造成影响。对蚜虫中肠消化酶的研究表明，蚜虫体内的氨肽酶（APs）、胰蛋白酶（Tr）、胰凝乳蛋白酶（CTP）为主要的消化酶。
据测定，丁布对于禾谷缢管蚜、麦长管蚜等均有较好的毒杀作用，但是关于丁布对苜蓿斑蚜的作用还需要研究。为此，本研究以苜蓿斑蚜为研究对象，详细研究了以不同浓度丁布人工饲喂苜蓿斑蚜对其存活率、繁殖率以及体内酶活性的影响，为揭示丁布对苜蓿斑蚜的控制作用提供数据支撑，为防治苜蓿害虫植物源农药的研发提供理论依据。
1.1 供试虫源
苜蓿斑蚜采集于国家牧草产业技术体系沧州试验站，位于河北省沧州市献县韩村镇北张白村日昇现代农业园区（38°18′ N，116°21′ E）。并于室内智能人工气候培养箱内饲养数代，培养条件为：温度（25±2）℃，相对湿度约65%，光周期16L∶8D。从已繁殖数代的苜蓿斑蚜中挑取健康的4 日龄蚜虫250 头，放入灭菌培养皿中并置于人工气候培养箱中黑暗饥饿处理5 h。
1.2 蚜虫饲料
蚜虫饲料采用纯人工饲料，饲料按照赵海龙等[13]的人工饲料配方配制，将配好的人工饲料混匀后经细菌过滤器过滤，分装保存至-20 ℃备用。
1.3 蚜虫饲育器的制作
蚜虫饲育器采用高约4 cm，直径约2 cm 的透明玻璃管，双层泊拉膜夹液态人工饲料构成，设有饲料储存室和蚜虫活动室。上面为双层泊拉膜饲料储藏室，下端用海绵或纱布封口通风。制作前，玻璃管及泊拉膜在紫外灯下杀菌数分钟，在无菌的条件下进行操作，双手避免接触泊拉膜的中间位置，防止饲料污染变质。
1.4 丁布对苜蓿斑蚜存活及繁殖力的影响
丁布为标准品，购买于北京威知生物技术有限公司，为固体粉末状试剂，于4 ℃保存备用。本试验共设置4 个处理组和1 个对照组，每个处理组和对照组均设有5 次重复，每次重复采用1 个装有10 头苜蓿斑蚜的饲育器。首先用第一层拉薄的泊拉膜封闭饲育器，在上面滴加200 μL 混合不同浓度丁布（200 μg/mL、400 μg/mL、600 μg/mL 和800 μg/mL）的人工饲料，再用第二层泊拉膜封闭。将蚜虫饲育器放入人工气候培养箱中，饲养条件为温度（25±2）℃，相对湿度约35%，光周期16L∶8D，光照强度9230 lx。每24 h观察记录苜蓿斑蚜成蚜的成活数，繁殖率，若蚜的成活数，72 h 后停止观察。
1.5 丁布对苜蓿斑蚜体内主要酶活性的影响
本试验共设置4 个处理组和1 个对照组，每个处理组和对照组均设有5 次重复，每次重复采用1 个装有10 头苜蓿斑蚜的饲育器。72 h 后取样。加入一定比例（缓冲比例2 μL/头）的PBS 缓冲液，采用液氮低温冰浴研钵将样品研磨成粉末状，离心10 min 左右（12000 r/min，4 ℃）取上清液，制成总蛋白粗提液，于-20 ℃保存备用。采用Elisa 试剂盒检测氨肽酶（APs）、胰凝乳蛋白酶（CTP）、胰蛋白酶（Tr）和总蛋白酶（Pr）活性
1.6 数据统计与分析
成蚜存活率、繁殖率及若蚜存活率计算方法：成蚜存活率（%）＝成蚜存活数/成蚜总数×100%；
繁殖率（%）＝若蚜繁殖总数/成蚜总数×100%；
若蚜存活率（%）＝若蚜存活数/若蚜繁殖总数×100%。
结果使用SPSS 20.0 软件进行单因素方差分析，采用多元线性回归方法进行显著性分析，分析结果采用Excel 2003 软件进行图表制作。
2.1 不同浓度丁布对苜蓿斑蚜成蚜存活率的影响
苜蓿斑蚜成蚜取食含不同丁布浓度的混合饲料后72 h 内存活率呈逐渐降低的趋势，在取食饲料72 h后存活率最低，且存活率随丁布浓度的升高而降低。72 h 后，取食丁布浓度为800 μg/mL 成蚜的存活率为30.7%，显著低于其他处理（P＜0.05）（图1）。
图1 不同浓度丁布对苜蓿斑蚜成蚜存活率的影响Fig.1 Effect of different DIMBOA’s concentrations on survivalrate of adult spotted alfalfa aphid
2.2 不同浓度丁布对苜蓿斑蚜繁殖率的影响
苜蓿斑蚜取食含不同浓度丁布的混合饲料72 h 内繁殖率逐渐下降。72 h 后取食丁布含量为600 μg/mL、800 μg/mL 的蚜虫繁殖率显著低于其他浓度（P＜0.05），分别为241.3%，174.8%（图2）。
图2 不同浓度丁布对苜蓿斑蚜成蚜繁殖率的影响Fig.2 Effect of different DIMBOA’s concentrations on reproduction rate of adult spotted alfalfa aphid
2.3 不同浓度丁布对苜蓿斑蚜若蚜存活率的影响
不同浓度的丁布对苜蓿斑蚜若蚜存活率均有一定的控制作用。高浓度的丁布混合饲料对苜蓿斑蚜若蚜的存活率影响最大，丁布含量为800 μg/mL 时，蚜虫取食72 h 后若蚜存活率最低，为35.8%。在丁布含量为200 μg/mL、400 μg/mL 时，处理组苜蓿斑蚜的若蚜存活率与对照组无显著差异（P＞0.05）（图3）。
图3 不同浓度丁布对苜蓿斑蚜若蚜存活率的影响Fig.3 Effect of different DIMBOA’s concentrations on survival rate of the larvae spotted alfalfa aphid
2.4 不同浓度丁布对苜蓿斑蚜体内酶活性的影响
苜蓿斑蚜取食含有不同浓度丁布的混合饲料后体内的氨肽酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、总蛋白酶均受到了不同程度的抑制，活力降低。其中低浓度时，酶活力降低均不明显，高浓度时，酶活力均显著降低（P＜0.05）。在浓度为800 μg/mL 时，相较于对照组，氨肽酶活力降低了61.5%，胰凝乳蛋白酶活力降低了67%，胰蛋白酶活力降低了65.1%，总蛋白酶活力降低了55.9%（图4）。
图4 不同浓度丁布对苜蓿斑蚜体内酶活性的影响Fig.4 Effect of different DIMBOA’s concentrations on enzyme activity in alfalfa aphid
植物源杀虫剂是利用具有杀虫活性成分的植物进行加工或提取其有效成分而制成的杀虫制剂，主要在于对植物次生代谢物质的利用[14,15]。20 世纪70 年代以来，国内外学者对具有杀虫作用的植物及其作用机制开展了广泛的研究和探索。植物中杀虫活性成分主要包括生物碱、萜烯类、精油类、光活化毒物以及黄酮类等，作用方式主要为拒食、触杀、胃毒、忌避、抑制生长发育等[16-18]。苯并噁嗪类物质作为杀虫活性成分的一种，许多学者对其抗虫性和作用特性也进行了研究。欧洲玉米螟在丁布的作用下化蛹和羽化平均时间显著延长，蛹和成虫体质量随丁布浓度增高而降低[19]。刘保川等[20]在麦长管蚜人工饲料中加入0.6 mg/g 的丁布，麦长管蚜几乎全部死亡。
许多研究表明丁布对于蚜虫的抑制机制主要是引起拒食作用。例如，麦二叉蚜和麦无网蚜取食混有丁布的人工饲料后成活率降低，麦二叉蚜的繁殖率也有所降低[21]，这与本试验的结果一致。有研究表明丁布对昆虫具有胃毒作用，主要是由于昆虫胰蛋白酶活性位点上丝氨酸残基的失活。α-胰凝乳蛋白酶中赖氨酸残基位于酶的表面，结合丁布以后，位于活性位点内部的丝氨酸残基提高了酶对丁布的亲和性，并与之反应而失活[22]。此外，许多研究显示丁布可通过影响蚜虫体内酶的活性来控制蚜虫。Leszczyaski 等[23]的研究认为，丁布能够显著降低麦长管蚜体内谷胱甘肽转移酶和尿苷二磷酸葡萄糖转移酶的活性。本文发现苜蓿斑蚜取食含有不同浓度丁布饲料后，胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶的活性得到了不同程度的抑制，酶活性随丁布浓度的增高而降低，也证明了丁布可通过影响蚜虫体内酶的活性对蚜虫起到抑制作用。还有研究表明，丁布能与昆虫蛋白酶结合后发生不可逆性抑制作用，活性位点上含有巯基的游离半胱氨酸残基的蛋白酶能够被丁布不可逆性抑制[24]。但是，本文仅发现了丁布可显著抑制害虫氨肽酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、总蛋白酶活性，但对苜蓿斑蚜起作用的具体剂量以及具体作用机制尚需更深入研究。
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