谢小林，王 勇，陈 猛，周 莲，李成江，刘玉敏，朱红惠
（1.广东省科学院微生物研究所/华南应用微生物国家重点实验室/农业农村部农业微生物组学与精准应用重点实验室/广东省菌种保藏与应用重点实验室/广东省微生物菌种保藏中心，广州 510070；
2.广东博沃特生物技术有限公司，韶关 512026；
3.华南农业大学，广州 510642）
木霉菌是一类广泛分布于土壤和植物体的真菌，目前已报道的木霉菌超过250 个种[1]，据报道对18个属29 种植物病原真菌有拮抗作用[2]，因其具有适应性好、定殖能力强和生防效果突出等特点，在植物病害防治上有着巨大的生防应用潜力[3-5]。常见生防木霉菌包括哈茨木霉T.harzianum、绿色木霉T.viride、拟康氏木霉T.pseudokoningii、棘孢木霉T.Asperellum和长枝木霉T.longibrachiatum等。
哈茨木霉作为一种目前在生物防治领域应用广泛的农用微生物菌种，具有抑制由尖孢镰刀菌、立枯丝核菌和炭疽菌等造成枯萎病、腐烂病、炭疽病等常见植物病害的良好效果[6-11]。木霉防治植物病原菌的主要表现为抢占生态位点，重寄生作用，分泌抑菌次级代谢产物和穿透病原菌并汲取其营养[14-16]。近些年，由于化肥农药的过度使用，已造成水土污染、农药残留和植物病害频发的生态环境问题。生防微生物是一种改善土壤生态环境和防治植物病害的较好选择[12,13]。哈茨木霉具有活性高、繁殖力强，价格低廉和生产方便的优势，在工业化生产上往往采用固态发酵方式来生产农用微生物菌剂[17,18]。众多学者对绿色木霉[19]、拟康氏木霉[20]、棘孢木霉[21,22]和长枝木霉[23,24]等常见木霉菌的固态发酵工艺水平研究的报道较多且技术相对成熟，而关于哈茨木霉固态发酵工艺条件优化的研究报道相对较少，且总体发酵水平偏低，在工业化生产中往往存在菌种混乱、功能不强、杂菌率高和发酵水平低等凸出的问题，严重阻碍了其工业化生产。因此，获得优良的哈茨木霉生防菌种、简易化操作程序和高水平发酵工艺对我国提高哈茨木霉工业规模化生产和促进农业经济发展有很大的帮助。
目前，工业化生产常用农业废弃物或农业副产品如麸皮、豆粕、谷壳、玉米粉、秸秆、果蔬残渣等进行农用微生物菌剂的固态发酵。王巧河等[25]以废菌棒为主要基质，主要成分为食用菌渣中的木材、麸皮和豆粕，通过固态发酵条件优化，有效提高哈茨木霉菌体数，优化后的产量为5.91×109CFU/g。曾庆才等[26]以养猪垫料为发酵物，通过固态发酵对哈茨木霉进行了发酵条件优化，产量达3.86×109CFU/g。张昊楠等[27]利用制药污泥发酵哈茨木霉，优化后发酵菌体数量为3.27×109CFU/g。上述研究主要集中在固态发酵后哈茨木霉的菌体数量上，发酵水平均不高（低于百亿级），其中发酵菌物烘干前后菌体数量变化情况也并未作相关研究。本研究通过平板对峙实验从番茄根际土壤分离筛选获得一株生防哈茨木霉BWT1.221，从不同物料构比、发酵条件方面进行了哈茨木霉的固态发酵条件优化，分析了哈茨木霉BWT1.221 固态发酵菌物烘干前后菌体有效活菌数及菌体数量占比，目的是提高哈茨木霉的固态发酵水平，有效延长哈茨木霉微生物菌剂的保存货架期，以期为哈茨木霉工业规模化生产提供有力的技术支撑。
1.1 供试材料
供试菌株：哈茨木霉BWT1.221 分离自番茄根际土壤，已保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌株保藏号为GDMCC No: 62833。
试剂：蔗糖、尿素、硫酸铵等试剂均为国产分析纯（AR）；
葡萄糖、蛋白胨、琼脂等实验试剂均为生化试剂（BR），采购于广东环凯生物科技有限公司。麸皮、玉米粉、豆粕、黄豆粉和米糠均来自某粮食加工厂。
仪器：恒温培养箱（SHP-080），广东环凯生物科技有限公司；
恒温摇床（HZQ-X300C），上海一恒科学仪器有限公司；
超净工作台（BSC-1304ⅡA2），苏州安泰空气技术有限公司；
干燥烘箱（LDO-9246A），上海龙跃仪器设备有限公司；
小型粉碎机（FTT-2500T），东莞市房太电器有限公司；
电子游标卡尺（MNT-150T），上海美耐特实业有限公司；
电子天平（JJ200），常熟市双杰测试仪器厂。
哈茨木霉培养基（PDA 培养基或斜面培养基，马铃薯葡萄糖琼脂培养基）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉16～20 g，自然水1 L。
种子液培养基（PDB，马铃薯葡萄糖培养基）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，自然水1 L。
1.2 哈茨木霉BWT1.221 与植物病原菌的平板对峙试验及抑制率测定
将哈茨木霉BWT1.221 与植物病原菌分别转接于PDA 固体平板上，于恒温培养箱中28 ℃静置培养5 d后，分别用打孔器（Φ=10 mm）沿菌落边缘打1 块菌饼，放入PDA 固体培养基中线对称两侧（一个生防菌菌饼对应一个病原菌菌饼），菌饼离PDA 培养基中线25 mm，共设置3 个重复处理，空白对照一侧不接入哈茨木霉BWT1.221，于28 ℃恒温培养箱中培养7 d，测量对照与处理病原菌菌落直径并计算哈茨木霉BWT1.221 拮抗植物病原菌的抑制率。
抑制率测定：参照文献[28]方法测量。使用电子游标卡尺分别测定病原菌空白对照和各处理组病原菌菌落的直径，每组重复测量3 次，菌落抑制率（%）＝（SCK-S1）/SCK×100，其中SCK 表示病原菌空白对照的直径距离（mm），S1 表示PDA 平板接种有哈茨木霉BWT1.221 和病原菌中的病原菌直径距离（mm）。
1.3 有效活菌数的计数方法
参照国家标准《GB 20287-2006 农业微生物菌剂》进行有效活菌体计数测定。本文中哈茨木霉BWT1.221 的有效活菌数指的是能够存活的哈茨木霉BWT1.221 总菌体数量，发酵菌物烘干前后菌体自定义为哈茨木霉BWT1.221 经过固态发酵结束后在烘干前和烘干后的菌体。烘干前后哈茨木霉BWT1.221 的有效活菌数的测定方法为：准确称取10.00 g 发酵烘干前后哈茨木霉BWT1.221 发酵物，装入已经高压灭菌（121 ℃，30 min）载有90 mL 自然水、25 个直径为0.5 cm 玻璃珠和0.1%吐温80 的250 mL 三角瓶中，于200 r/min 恒温摇床自然条件下充分振荡30 min，获得哈茨木霉BWT1.221 菌悬液（菌体充分打散），通过平板稀释涂布方法计数有效活菌数，每个处理重复3 次。
1.4 哈茨木霉BWT1.221 的活化和种子液的制备
首先，将哈茨木霉BWT1.221 冻干管从保藏于4℃低温冰箱中取出，移液枪吸取100 μL 无菌水于冻干管中溶解后，转移至装有PDA 培养基的平板中进行涂布，于28 ℃恒温培养箱中静置培养48 h，进行菌体活化。待培养好后用打孔器打取菌饼，用接种环转移至装有PDA 培养基的平板上进行复壮（恢复真菌繁殖性能）培养48 h。然后，将复壮培养后的哈茨木霉BWT1.221 菌饼用接种环移至载有300 mL PDB 培养基的1 L 三角瓶中，于28 ℃、200 r/min 恒温摇床中振荡培养48 h，制备获得种子液。
1.5 哈茨木霉BWT1.221 固态发酵条件优化
1.5.1 不同物料成分 物料成分分别设为全部麸皮、麸皮∶玉米粉=1∶1、麸皮∶豆粕粉=1∶1、麸皮∶黄豆粉=1∶1、麸皮∶米糠=1∶1 和米糠∶玉米粉=1∶1。参照文献[29]方法，即分别在500 mL 三角瓶中装入以上不同物料成分，按初始料水比=1∶0.7 加入自然水，均匀混拌、润料30 min，经高压灭菌冷却后，添加5%哈茨木霉BWT1.221 种子液，充分摇荡混合均匀后，静态直立放置于28 ℃恒温培养箱中，待菌丝长满后充分摇碎物料，继续发酵2 d 后放倒平行培养（直立三角瓶倾斜90°进行培养，增加物料碎屑与哈茨木霉菌体的表面接触），每个处理重复3 次，发酵7 d 后进行哈茨木霉BWT1.221 烘干前后菌体有效活菌数计数，菌体计数方法参照1.3（以下同）。
1.5.2 不同物料比例 以麸皮和玉米粉作为发酵基质，麸皮:玉米粉的物料比例分别设为0.25∶1、0.5∶1、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1。按以上物料比例进行哈茨木霉BWT1.221 固态发酵，其中初始料水比为1∶0.7，然后参照1.5.1 所述方法（以下同），进行润料、灭菌、摇碎、接菌、发酵和烘干粉碎，发酵7 d 后，测定烘干前后菌体有效活菌数，每个处理重复3 次。
1.5.3 不同料水比 料水比分别设为1∶0.4、1∶0.5、1∶0.6、1∶0.7、1∶0.8、1∶0.9、1∶1。按以上料水比进行哈茨木霉BWT1.221 固态发酵，其中麸皮∶玉米粉=0.25∶1，进行润料、灭菌、摇碎、接菌、发酵和烘干粉碎，发酵7 d 后，测定烘干前后菌体有效活菌数，每个处理重复3 次。
1.5.4 速效碳源 速效碳源（蔗糖）比例分别设为0、1%、2%、3%、4%、5%、6%（占干物料比重）。按以上速效碳源（蔗糖）比例添加进行哈茨木霉BWT1.221 固态发酵，其中麸皮∶玉米粉=0.25∶1，料水比为1∶0.7，进行润料、灭菌、摇碎、接菌、发酵和烘干粉碎，发酵7 d 后，测定烘干前后菌体有效活菌数，每个处理重复3 次。
1.5.5 速效氮源 速效氮源（尿素）比例分别设为0、0.1%、0.2%、0.5%，速效氮源（硫酸铵）比例分别设为0.1%、0.5%、1%、2%。上述速效氮源比例均为占干物料比重。按以上速效氮源（尿素）比例和速效氮源（硫酸铵）比例添加进行哈茨木霉BWT1.221 固态发酵，其中麸皮∶玉米粉=0.25∶1，料水比为1∶0.7，进行润料、灭菌、摇碎、接菌、发酵和烘干粉碎，发酵7 d 后，测定烘干前后菌体有效活菌数，每个处理重复3 次。
1.5.6 发酵物料组成正交实验 根据1.5.4 和1.5.5 单因素试验结果，以哈茨木霉BWT1.221 烘干前后菌体有效活菌数作为考察指标，设计3 因素3 水平的正交实验，共进行13 组（分组无重复），每组进行3 次重复实验。正交实验设计方案如表1 所示。
表1 发酵物料组成正交因子水平表Table 1 The composition factors of fermentation material
1.5.7 不同发酵温度 发酵温度分别设为22 ℃、25 ℃、28 ℃、31 ℃、34 ℃、37 ℃。按以上不同发酵温度进行哈茨木霉BWT1.221 固态发酵，其中麸皮∶玉米粉=0.25∶1，料水比为1∶0.7，蔗糖为5%，尿素和硫酸铵分别为0.15%和0.8%，进行润料、灭菌、摇碎、接菌、发酵和烘干粉碎，发酵7 d 后，测定烘干前后菌体有效活菌数，每个处理重复3 次。
1.5.8 不同发酵时间 发酵时间分别设为4、5、6、7、8、9 和10 d。按以上不同发酵时间进行哈茨木霉BWT1.221 固态发酵，其中麸皮∶玉米粉=0.25∶1，料水比为1∶0.7，蔗糖为5%，尿素和硫酸铵分别为0.15%和0.8%，发酵温度为28 ℃，进行润料、灭菌、摇碎、接菌、发酵和烘干粉碎，发酵7 d 后，测定烘干前后菌体有效活菌数，每个处理重复3 次。
1.6 发酵物烘干和粉碎参数
将充分发酵完毕后的哈茨木霉BWT1.221 潮湿发酵物经恒温烘箱烘干，烘干参数为：在28 ℃恒温烘箱中烘干24 h；
其后使用小型粉碎机将烘干后的发酵物进行粉碎，粉碎参数为：粉碎机转数2000 r/min，每隔10 s 粉碎1 次，其间冷却后继续粉碎，共粉碎3 次。
1.7 发酵菌物烘干前后菌体数量占比
试验中发酵菌物烘干前后菌体数量占比的定义为哈茨木霉BWT1.221 经固态发酵结束后烘干粉碎的发酵菌体有效活菌数占烘干前发酵菌体（除去水分因素）有效活菌数的百分比。
发酵菌物烘干前后菌体数量占比（%）=[烘干后菌体有效活菌数（×109CFU/g）/烘干前菌体有效活菌数（×109CFU/g）]×[（1-烘干菌体含水比例（%））/（1-发酵物料含水比例）（%））]×（1-添加含水率）×100。
1.8 数据统计与分析
采用SPSS v.19.0.1 对数据进行统计分析，采用One-way ANOVA 中Duncan 进行多种比较分析。采用SPSS v.19.0.1 进行正交设计和方差分析。采用OriginPro 2021 进行绘图。
2.1 哈茨木霉BWT1.221 对不同植物病原菌的抑制效果
通过平板对峙试验，对病原菌直径测量和抑制率计算（表2）结果表明，哈茨木霉BWT1.221 对常见的植物病原菌腐皮镰刀菌、香蕉炭疽菌、立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、禾谷镰孢菌均具有抑制效果，其中哈茨木霉BWT1.221 对尖孢镰刀菌和立枯丝核菌的抑制效果最好，分别为61.06%和60.87%，与其他病原菌均达差异性显著（P＜0.05），对禾谷镰孢菌的抑制效果相对较低。
表2 哈茨木霉BWT1.221 对不同植物病原菌的生长影响及抑制作用Table 2 Effect of T.harzianum BWT1.221 on growth and inhibition of plant pathogen
2.2 不同物料成分对哈茨木霉BWT1.221 固态发酵有效活菌数的影响
选取不同物料成分，比例均按1:1 混合进行固态发酵，结果表明麸皮和玉米粉混合物发酵效果最佳（如图1），烘干前和烘干后有效活菌数分别为3.19×109和3.34×109CFU/g，与其他物料成分均达差异性显著（P＜0.05），发酵菌物烘干前后菌体数量占比为61.59%；
发酵效果最差的为单种物料麸皮，烘干前和烘干后有效活菌数分别为0.87×109和1.05×109CFU/g，但发酵菌物烘干前后菌体数量占比最高，为71.27%。
2.3 不同物料比例对哈茨木霉BWT1.221 固态发酵有效活菌数的影响
以麸皮和玉米粉作为基础发酵物料，通过不同物料比例进行哈茨木霉BWT1.221 固态发酵结果如图2，在麸皮:玉米粉=0.25:1 的比例下发酵效果最佳，烘干前和烘干后有效活菌数分别为4.00×109和4.28×109CFU/g，显著高于其他物料比例处理（P＜0.05），发酵菌物烘干前后菌体数量占比为62.94%。
图2 不同物料比例对哈茨木霉BWT1.221 固态发酵的影响Fig.2 Effects of different material proportions on solid fermentation of T.harzianum BWT1.221
2.4 不同料水比对哈茨木霉BWT1.221 固态发酵有效活菌数的影响
在一定的料水比例范围内，随着料水比例的增加哈茨木霉BWT1.221 有效活菌数呈现先上升后降低的现象（图3）。当料水比为1∶0.7 时发酵菌数最高，烘干前和烘干后有效活菌数分别为4.23×109和4.51×109CFU/g，与料水比为1∶0.8 时差异不显著（P＞0.05），但与其他料水比均差异显著（P＜0.05），发酵菌物烘干前后菌体数量占比为62.67%。
2.5 不同速效碳源（蔗糖）添加量对哈茨木霉BWT1.221 固态发酵有效活菌数的影响
速效碳源对哈茨木霉BWT1.221 固态发酵的影响结果如图4 所示，在一定蔗糖添加量范围内随着添加量的增加菌体数量不断提高，当蔗糖添加量达到5%时开始缓慢提高，蔗糖添加量5%与6%之间菌体数量变化差异不显著（P＞0.05），但与其他蔗糖添加量均呈差异性显著（P＜0.05），烘干前有效活菌数分别为7.97×109和8.06×109CFU/g，烘干后分别为8.15×109和8.27×109CFU/g，发酵菌物烘干前后菌体数量占比分别为60.18%和60.33%。
图4 速效碳源蔗糖对哈茨木霉BWT1.221 固态发酵的影响Fig.4 Effects of available carbon source on solid fermentation of T.harzianum BWT1.221
2.6 不同速效氮源（尿素和硫酸铵）添加量对哈茨木霉BWT1.221 固态发酵有效活菌数的影响
本试验研究了速效氮源尿素和硫酸铵添加量对哈茨木霉BWT1.221 固态发酵的影响，结果表明（如图5），菌体数量变化均随尿素和硫酸铵添加量增加而呈先升高后下降趋势。尿素添加量0.1%时烘干前和烘干后有效活菌数分别为4.50×109和4.85×109CFU/g，硫酸铵添加量1%时，烘干前和烘干后有效活菌数分别为5.87×109和6.18×109CFU/g，与其他尿素或硫酸铵添加量均呈差异性显著（P＜0.05），发酵菌物烘干前后菌体数量占比分别为63.40%和61.93%；
当尿素和硫酸铵添加量分别达0.2%、1%后烘干前后菌体有效活菌数和菌体数量占比均骤降，这说明在一定程度上高浓度速效氮源添加量会抑制哈茨木霉的生长。综上，速效氮源尿素和硫酸铵的添加量分别为0.1%和1%。
图5 速效氮源对哈茨木霉BWT1.221 固态发酵的影响Fig.5 Effects of available nitrogen source on solid fermentation of T.harzianum BWT1.221
2.7 发酵培养基组分正交实验
通过对哈茨木霉BWT1.221 发酵培养基中的碳氮源成分进行正交实验结果表明（表3），最佳发酵组合为A2B3C1，即蔗糖添加量为5%，尿素添加量为0.15%，硫酸铵添加量为0.8%，菌体数量最高，烘干前和烘干后有效活菌数分别为10.20×109和10.78×109CFU/g，经发酵菌体进行平板稀释涂布后观察不存在杂菌污染（杂菌率≤0.01%）。因此，添加适量碳氮源，有利于获得最佳菌体有效活菌数量。
表3 发酵培养基正交试验结果Table 3 Orthogonal test results of fermentation medium
2.8 不同发酵温度对哈茨木霉BWT1.221 固态发酵有效活菌数的影响
发酵温度是影响哈茨木霉BWT1.221 固态发酵的最关键因素之一。试验结果表明（图6），随着发酵温度的升高，烘干前后菌体有效活菌数和菌体数量占比均呈先上升后降低的趋势，28 ℃时达到最高，与其他温度变化均呈差异性显著（P＜0.05），烘干前和烘干后菌体有效活菌数分别为9.74×109和10.17×109CFU/g，发酵菌物烘干前后菌体数量占比为61.42%。
图6 不同发酵温度对哈茨木霉BWT1.221 固态发酵的影响Fig.6 Effects of different fermentation temperatures on solid fermentation of T.harzianum BWT1.221
2.9 不同发酵时间对哈茨木霉BWT1.221 固态发酵有效活菌数的影响
发酵时间长短也会影响哈茨木霉BWT1.221 固态发酵水平。在一定时间范围内，哈茨木霉BWT1.221固态发酵烘干前后菌体有效活菌数和菌体数量占比均呈先升高后下降的趋势（图7），发酵第7 d 时，菌体生长状态呈平稳水平，而9 d 后其烘干前后菌体有效活菌数和菌体数量占比均呈下降趋势。发酵7 d 的哈茨木霉BWT1.221 烘干前和烘干后有效活菌数分别为9.83×109和10.36×109CFU/g，发酵菌物烘干前后菌体数量占比为62.00%。在哈茨木霉固态发酵生产应用中，综合考虑木霉产量和发酵成本，选择7 d 作为一个发酵周期。
图7 不同发酵时间对哈茨木霉BWT1.221 固态发酵的影响Fig.7 Effects of different fermentation time on solid fermentation of T.harzianum BWT1.221
哈茨木霉作为具有拮抗尖孢镰刀菌、立枯丝核菌和炭疽菌等常见植物病原菌优越性能的生防菌种，广泛应用于农作物的病害防治。目前，由于市场上生防功能较强的哈茨木霉资源匮乏，所制备获得的微生物菌剂中生防菌种存在功能弱、污染严重以及发酵水平低下等凸出问题，本研究通过平板对峙法筛选获得一株生防菌株哈茨木霉BWT1.221，结合不同发酵物料和发酵条件进行单因素和正交实验，研究了该菌株发酵条件优化中烘干前后菌体有效活菌数及菌体数量占比的变化情况，旨在提高哈茨木霉的固态发酵水平和为工业规模化生产提供有力的科学数据参考。
功能微生物的固态发酵条件优化对于生防菌株在工业化生产的高量扩繁和节本增效方面具有重要意义。发酵物料及培养条件的优化是生防菌株固态发酵的关键步骤。在哈茨木霉BWT1.221 固态发酵过程中，发酵物料的选择对发酵水平有较大的影响，本研究采用来源广泛、价格低廉和营养丰富[30]的麸皮、玉米粉等可利用农业副产品作为发酵基质，经过固态发酵条件优化后菌体数量提高3.23 倍，达到10.78×109CFU/g。与肖荣凤等[31]利用养猪垫料及张昊楠等[27]利用制药污泥进行哈茨木霉固态发酵的来源完全不同，其最终发酵的菌体数量分别为（4.33～4.46）×108和3.27×109CFU/g，明显低于本研究发酵水平。王永东等[30]研究结果表明利用麸皮和玉米粉发酵哈茨木霉的最佳比例为3:1，与本研究最佳发酵比例不同，这可能是物料属性（粗细、含水量等）、菌株特性和原料搭配等原因导致。
从本研究中可以看出，不同发酵条件对哈茨木霉BWT1.221 发酵水平有很大的影响。料水比是固态发酵的关键因子，低水分和高水分均会影响哈茨木霉固态发酵烘干前后菌体有效活菌数和菌体数量占比。有研究表明，水分低时使得物料干燥无法满足菌体萌发和菌丝的生长，高水分容易造成物料成团无法长透整体，不容易产孢[26]。碳氮源的添加对哈茨木霉固态发酵实现量产必不可少，碳源蔗糖和氮源尿素、硫酸铵均是市场上容易获得的原料，王永东等[30]和茹水江[32]都认为蔗糖是哈茨木霉固态发酵最佳碳源，而且适当的碳源比例能够促进菌体高产。氮源尿素和硫酸铵的添加量对哈茨木霉固态发酵的影响较大，适当的添加能够促进菌体生长，而过高的添加量则严重使得固态发酵烘干前后菌体有效活菌数和菌体数量占比骤降，这与周莲等[29]对真菌固态发酵研究结果一致。低温和高温对哈茨木霉BWT1.221 固态发酵程度的影响巨大，低温菌体生长较慢，分生孢子产生量低，造成整体发酵菌体数量偏低；
高温对菌体生长有抑制，由于生存环境产生逆境胁迫，大量菌体死亡，从而导致固态发酵烘干前后菌体有效活菌数和菌体数量占比也均呈现出较低的结果。随着哈茨木霉固态发酵中生存空间，营养、水分及氧气等生存物质的不断消耗，发酵到一定时间将不再继续生长。在固态发酵过程中，由于纯菌种单独发酵，严格控制发酵技术参数，基本无杂菌污染（杂菌率低于0.01%）。
本研究前期工作仅进行了实验室初期的哈茨木霉固态发酵工艺条件优化，生长环境和营养条件均会产生影响。后期将集中对哈茨木霉高产分生孢子及抑菌物质（次级代谢产物）的提取与分析进行相关研究，将在工厂发酵车间进行哈茨木霉固态发酵小、中试试验以及在菌剂高塔喷雾和低温超微粉碎技术实现突破，以期获得产量大、货架期长的生防微生物菌剂产品，为农作物的生物防治提供技术支撑。
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