刘利阳 黄声秀 姚清达 杨伟强 倪建聪
（闽南师范大学化学化工与环境学院，漳州 363000）
胆固醇（Cholesterol，CHOL）也称胆甾醇，是多种疾病诊断的重要生理指标[1-2]。体内高水平的CHOL是诱发高血压[3]、动脉硬化[4]和心肌梗塞[5]等多种疾病的主要因素，而低水平的CHOL 也可能会导致低脂蛋白[6]、败血症[7]、甲亢[8]和肝病[9]等疾病。因此，准确、灵敏地检测体内CHOL 含量对临床诊断和疾病预防非常重要。目前，常用的CHOL 检测方法包括酶法[10]、比色法[11]、高效液相色谱（HPLC）法[12]、荧光法[13]、电化学法[14]、电化学发光（Electrochemiluminescence，ECL）法[15]等。其中，ECL 法是在电极表面施加一定的电压，使发光体电激发形成激发态，在回到基态过程中以光的形式释放能量，从而获得ECL 响应信号[16-17]。ECL 具有高灵敏、低背景、简单可控等特点，在临床分析诊断领域广泛应用[18-19]。但是，在检测生物样本时，ECL 传感过程易受到复杂基质的干扰，产生非特异性检测信号。双极电极（Bipolar electrode，BPE）是在外加电场驱动下导体两端发生极化的现象，将其与ECL 结合可以构建传感端和信号端分离的双极电极-电化学发光（BPE-ECL）检测方法[20]。如Lu 等[21]在印刷电极上设计一段碳基双极电极，其阴极端修饰的核酸探针在靶标赭曲霉毒素A 的存在下引发杂交链式反应并结合辣根过氧化物酶，催化苯胺/过氧化氢的聚合反应；
阳极端信号池中的钌联吡啶/三正丙胺（Ru（bpy）32+/TPrA）发光体系的信号受阴极端催化过程的电子转移调控。通过构筑分离的传感检测池和信号收集池，可以避免样本基质对发光体系的直接干扰。BPE-ECL 传感模式近年来受到了广泛关注，并已被开发用于DNA[22]、癌症标志物[23]和细菌[24]等靶标的检测，但尚无将BPE-ECL 体系用于人体内CHOL 含量检测的报道。
本研究开发了一种酶催化的BPE-ECL 传感平台用于测定人血清中CHOL 的含量，此传感器具有传感/信号分离的特点。如图1 所示，利用光刻法在氧化铟锡（Indium tin oxide，ITO）导电玻璃电极上刻蚀出导电ITO（绿色部分）的双极电极及外接驱动电极，并在驱动电极负极和BPE 阴极电沉积纳米金（AuNPs，黄色部分）；
利用聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS）在BPE 的阴极端和阳极端分别构筑独立的传感检测池和信号收集池（白色部分）。在BPE 阴极端电聚合壳聚糖（CS）并固定胆固醇氧化酶（Cholesterol oxidase，CHOx），在信号池中加入Ru（bpy）32+/TPrA 作为发光信号源。当检测池中存在CHOL 时，CHOx催化氧化CHOL 分解并生成H2O2；
在外电压的驱动下，BPE 保持电荷守恒但两端发生极化[25]，阴极端的H2O2发生还原反应，并将电子转移至BPE 阳极端，引发信号池中Ru（bpy）32+/TPrA 的氧化反应，从而产生较强的ECL 响应。随着检测池中CHOL 浓度增大，BPE 阴极端的CHOx 催化产生更多的H2O2，从而使信号池的ECL 信号更强，由此建立了一种传感/信号分离的CHOL 检测新方法。
图1 双极电极-电化学发光胆固醇酶传感器的构建及传感原理示意图Fig.1 Schematic of construction and sensing mechanism of BPE-ECL enzymatic biosensor for detection of cholesterol
1.1 仪器与试剂
CHI 660E 电化学工作站（上海辰华仪器公司）；
BPCL-1-T 微弱发光仪（北京亚泊斯仪器公司）；
FR224CN 电子天平（上海奥斯豪仪器有限公司）；
JSM-IT510 扫描电子显微镜（日本电子株式会社公司）；
DZF-6050 真空干燥箱（上海驰唐实业有限公司）；
KDC-40 高速离心机（美国瓦里安公司）；
ITO 电极（华南湘城科技有限公司）；
Direct-Q 超纯水仪（美国Millipore 公司）。
CHOL、CHOx、Ru（bpy）32+、TPrA、HAuCl4、K3Fe（CN）6、K4[Fe（CN）6、正性光刻胶（AZP4620）和PDMS 购自上海阿拉丁试剂有限公司；
HNO3、HCl、HAc、NaOH、KCl、戊二醛（GA）、抗坏血酸（AA）、尿酸（UA）、柠檬酸（CA）、多巴胺（DA）、葡萄糖（Glu）、维生素E（VE）、CS 和磷酸盐缓冲溶液（PBS）购自国药集团化学试剂有限公司；
人血清样本由福建省漳州市医院提供，患者知情同意，相关研究经过伦理委员会批准。所用试剂均为分析纯；
实验用水均为超纯水（18.2 MΩ·cm）。
1.2 实验方法
1.2.1 ITO电极的图案化制备
参照文献[26]，利用光刻法对ITO 电极进行图案化处理。将ITO 电极粘附在甩胶机的旋转圆盘上，并涂覆正性光刻胶，以3000 r/min 甩胶40 s 使之均匀；
将ITO 电极置于110 ℃烤胶机上加热3 min，冷却至室温后，将光刻掩版置于ITO 电极表面并在紫外灯下曝光4 min；
将ITO 电极浸没在0.7%NaOH 溶液中显影；
将光胶图案化的ITO 电极浸入HNO3/HCl/H2O 刻蚀液（4∶5∶5，V/V）中，刻蚀掉暴露的ITO 层，超声20 min 除去表面的光胶，即可得到导电部分图案化的ITO 电极。
1.2.2 BPE传感器的制备
在驱动电极负极和BPE 阴极电沉积AuNPs。在检测池与信号池中分别加入100 μL HAuCl4溶液（2.4 mmol/L，含0.1 mol/L KCl），施加6.0 V 的外电压300 s，然后用水将ITO 电极冲洗干净。
将PDMS 预聚物和固化剂按质量比10∶1 进行混合，搅拌，真空脱气30 min 后倒入模具，于60 ℃固化3 h。用打孔器将固化后的PDMS 制成方形池（直径10 mm，孔深3 mm），并粘贴于ITO 双极电极部分的两端，即制得BPE 传感器。
1.2.3 CHOx的固定
在检测池中加入CS 的1%乙酸溶液，信号池中加入100 mmol/L PBS 缓冲液，施加‒0.4 V 的外电压200 s，即可在BPE 的阴极端电聚合上CS 薄膜。在BPE 阴极端滴加20 μL CHOx（1.0 mg/mL）与2 μL 戊二醛（1%）的混合溶液，待电极干燥后，重复该操作3 次。
1.2.4 CHOL的ECL检测
在检测池中加入100 μL 含不同浓度CHOL 的PBS 溶液（100 mmol/L，pH=7.0），在信号池中加入100 μL 含1 mmol/L Ru（bpy）32+和5 mmol/L TPrA 的PBS 溶液（100 mmol/L，pH=7.0）。将传感器在37 ℃孵育25 min 后进行ECL 测试，每个样品均进行3 次重复测试。ECL 检测条件：BPCL 工作电压为800 V；
循环伏安法（Cyclic voltammetry，CV）扫描电压范围为1.0～4.0 V，扫速为100 mV/s。采用本方法检测血清中的CHOL，同时进行加标回收实验，并与HPLC 检测结果进行比较。
2.1 不同修饰电极的表征
BPE 阴极端位于检测池内，其上负载的CHOx 催化CHOL 水解生成H2O2，其表面修饰情况对传感器的性能有重要影响。利用扫描电镜（SEM）对BPE 阴极端修饰过程进行了表征。由图2A 可见，裸ITO 电极表面非常洁净；
由图2B 可见，BPE 阴极端电沉积AuNPs 后，AuNPs 比较致密且基本覆满电极表面。电沉积AuNPs 避免了ITO 电极在高负电位下损坏，并加快电子转移速率。为了给CHOx 提供有效负载位点，在BPE 阴极端电聚合一层CS 薄膜得到CS/AuNPs/ITO，在电极的表面和截面（图2C）均可见CS 薄膜均匀地覆盖在BPE 阴极端。采用滴涂的方式将CHOx 固定在BPE 阴极端得到CHOx/CS/AuNPs/ITO，滴涂后的CHOx 呈圆球形且几乎将电极表面覆满，上层表面还具有凹陷的活性位点（图2D），表明CHOx 成功修饰在BPE 阴极表面。
图2 BPE 阴极端修饰电极表面的扫描电镜（SEM）图：（A）ITO；
（B）AuNPs/ITO；
（C）CS/AuNPs/ITO；
（D）CHOx/CS/AuNPs/ITO。插图为对应的电极截面图Fig.2 Surface and cross-sectional scanning electron microscopy (SEM) images of modified BPE cathode:(A) Bare ITO;(B) AuNPs/ITO;(C) CS/AuNPs/ITO;(D) CHOx/CS/AuNPs/ITO.Insets are corresponding cross sections of different electrodes
采用电化学方法研究BPE 阴极端的传感性能。[Fe（CN）6]3–/4–探针在不同修饰BPE 阴极上的CV 曲线如图3A 所示，与裸ITO（曲线a）相比，电沉积AuNPs 的电极界面（曲线b）具有更高的电化学信号，说明AuNPs 的沉积增强了电极的导电性；
电聚合CS 后，CS/AuNPs/ITO（曲线c）的电化学响应信号降低，这是由于CS 导电性较差，阻碍了电极表面的电子传递；
滴涂CHOx 后，CHOx/CS/AuNPs/ITO（曲线d）的电化学信号进一步降低，说明CHOx 成功固定在电极表面。电化学交流阻抗谱（EIS）表征结果如图3B 所示，裸ITO（曲线a）的Nyquist 曲线在高频区呈现较小的半圆，表明电极的电子传递阻抗（Ret）较小，探针[Fe（CN）6]3‒/4‒在该界面的电子传递速率较快；
电沉积AuNPs 后，阻抗谱图中半圆直径减小（曲线b），表明AuNPs 有利于促进电子传递；
由于CS 导电性差，CS/AuNPs/ITO 的半圆直径明显增大（曲线c）；
CHOx/CS/AuNPs/ITO的半圆直径进一步增大（曲线d），表明大量不导电的酶固定在电极表面。以上EIS 结果表明，BPE 阴极传感端已成功构建。
图3 BPE 阴极端不同修饰电极在含1.0 mmol/L 的[Fe（CN）6]3–/4–的0.1 mol/L KCl 溶液中的（A）循环伏安（CV）图和（B）交流阻抗（EIS）图：（a）ITO；
（b）AuNPs/ITO；
（c）CS/AuNPs/ITO；
（d）CHOx/CS/AuNPs/ITOFig.3 (A) Cyclic voltammetry (CV) and (B) electrochemical impedance spectroscopic (EIS) characterization of different BPE cathodes in 100 mmol/L KCl solution containing 1.0 mmol/L [Fe(CN)6]3–/4–: (a) Bare ITO;(b) AuNPs/ITO;(c) CS/AuNPs/ITO;(d) CHOx/CS/AuNPs/ITO
2.2 实验条件的优化
为了使传感器性能达到最佳，对检测池BPE 阴极端的CHOx 的固载量、酶催化反应的温度、缓冲液pH 值和反应时间进行了优化。首先考察了BPE 阴极端CHOx 固载量对传感器性能的影响。如图4A 所示，随着滴加的CHOx 酶固定液浓度增加，ECL 信号逐渐增大，表明CHOx 固载量增多，能够有效催化CHOL 并产生大量的H2O2，使阳极端的ECL 信号增强；
当酶固定液浓度超过1.0 mg/mL 时，ECL 信号基本维持稳定。因此，后续实验中选择CHOx 酶固定液浓度为1.0 mg/mL。催化反应温度的影响如图4B 所示，ECL 信号随着催化反应温度上升而增强，并在37 ℃时达到最大值，之后随温度增加而逐渐下降。这是因为酶催化反应通常有一个最适温度。本研究中CHOx 催化反应的最适温度为37 ℃。检测池中溶液pH 值对传感器的ECL 信号的影响如图4C 所示，随着检测池溶液pH 值逐渐升高，ECL 信号先上升，在pH ＞7.0 后下降。因此，选取pH=7.0 的PBS 缓冲溶液进行后续实验。酶的催化反应时间也是影响电极ECL 信号的重要因素，如图4D 所示，在5～25 min 的时间范围内，随着酶催化反应时间延长，ECL 信号不断增大，这是因为催化反应时间越长，CHOx 催化CHOL 生成的H2O2越多；
但是，酶催化反应时间超过25 min 后，ECL 信号反而减弱，这可能是一部分H2O2分解所致。综合考虑响应信号和检测时效，选择25 min 作为CHOx 最佳催化反应时间。
图4 （A）CHOx 浓度、（B）催化反应温度、（C）pH 值和（D）催化反应时间对传感器ECL 信号强度的影响；
检测池：1 mmol/L CHOL 溶液;信号池：1 mmol/L Ru（bpy）32++5 mmol/L TPrAFig.4 Effects of (A) concentration of CHOx,(B) temperature,(C) pH value and (D) incubation time on ECL signal intensity.1 mmol/L cholesterol in sensing cell;1mmol/L Ru(bpy)32++5 mmol TPrA in reporting cell
2.3 传感器的分析性能
在最优的实验条件下，对不同浓度的CHOL 溶液进行了检测。随着检测池中CHOL 溶液浓度增大，BPE 信号池ECL 信号逐渐增大（图5A）。以ECL 信号强度为纵坐标、CHOL 浓度的对数值为横坐标，绘制工作曲线，如图5B 所示，ECL 强度与CHOL 浓度（1 μmol/L～10 mmol/L）的对数具有良好的线性关系，线性方程为I=2372.4×lg[C/（μmol/L）]+1081.4（R2=0.998），检出限为0.13 μmol/L（S/N=3）。与文献报道的其它CHOL 检测方法相比（表1），本方法检测时间短、检出限低、线性范围宽。本方法采用的BPE 传感信号分离模式有效避免了发光试剂与待检测溶液的干扰，可获得灵敏且稳定的检测信号。
表1 不同CHOL检测方法性能比较Table 1 Comparison of analytical performances of different CHOL assays
图5 （A）传感器对不同浓度CHOL 的ECL 响应信号；
（B）ECL 信号强度随CHOL 浓度对数值变化的线性关系曲线。检测池CHOL 浓度（a →l）：1、5、10、25、50、100、250、500、1000 μmol/L，2.5、5、10 mmol/L；
信号池：1 mmol/L Ru（bpy）32++5 mmol/L TPrAFig.5 (A) ECL response of different concentrations of CHOL;(B) Linear relationship between ECL intensity and logarithmic concentrations of CHOL.Concentrations of CHOL (a →l) are 1,5,10,25,50,100,250,500,1000 μmol/L,2.5,5,10 mmol/L,respectively.1 mmol/L Ru(bpy)32++5 mmol TPrA in reporting cell
2.4 传感器的抗干扰性、重现性与稳定性
为了考察此BPE-ECL 酶生物传感器的选择性，在检测池中加入10 mmol/L 的AA、UA、CA、DA、Glu 和VE 等潜在干扰物，并与1 mmol/L CHOL 溶液的阳极ECL 信号进行对比。由图6A 可见，此传感器对CHOL 溶液具有良好的ECL 响应，而对上述干扰物无明显ECL 响应，说明此传感器对CHOL 具有良好的选择性。在检测池分别加入1、100 和1000 μmol/L CHOL 溶液，进行3 次重复检测，结果如图6B 所示，各浓度下ECL 响应信号的相对标准偏差（RSD）分别为2.2%、1.4%和1.8%，说明传感器具有良好的重现性。如图6C 所示，在检测池中加入100 μmol/L CHOL 溶液，8 次连续扫描的ECL 信号的RSD 为2.3%，表明此传感器具有良好的稳定性。
图6 传感器的（A）选择性（CHOL 浓度为1 mmol/L，干扰物浓度为10 mmol/L）、（B）重现性（CHOL 浓度分别为1、100 和1000 μmol/L）和（C）稳定性（100 μmol/L CHOL）实验结果，信号池中均为1 mmol/L Ru（bpy）32++5 mmol/L TPrAFig.6 (A) Selectivity (1 mmol/L CHOL,and 10 mmol/L each interferent),(B) reproducibility;(1,100 and 1000 μmol/L CHOL,respectively)and(C)stability(100 μmol/L CHOL)of the sensor.All reporting cells contain 1 mmol/L Ru(bpy)32++5 mmol/L TPrA
2.5 实际样品分析
利用此传感器对3 个人血清样本中的CHOL 浓度进行测试，并进行加标回收实验，评估此传感器对实际样品的检测性能，结果如表2 所示，加标回收率在98.4%～104.0%之间，RSD ＜4.7%。将此传感器检测结果与HPLC 检测结果进行比对，二者无明显差异，表明此传感器可准确测定复杂血清样品中的CHOL 浓度。
表2 人血清样品中CHOL的检测结果Table 2 Detection results of CHOL in human serum samples
基于BPE-ECL 技术构建了一种酶传感平台并用于CHOL 的检测。构筑了空间独立的传感检测池和信号收集池，将CHOx 固定在BPE 阴极端，催化CHOL 分解，由产生的H2O2在阴极端的还原过程诱导阳极端的Ru（bpy）32+/TPrA 发生氧化反应，从而产生ECL 检测信号，实现了对不同浓度CHOL 的检测。将此传感器用于人血清中CHOL 的检测，表现出良好的准确性和抗基质干扰能力。这种传感/信号分离的模式避免了样本基质对发光信号的直接干扰，在生物传感检测领域具有良好的应用前景。
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