李成尧 杨景龙 王雪旦 史瑞明
(1.西安交通大学第二附属医院小儿内科,西安 710004)(2.西安交通大学第一附属医院儿科,西安 710061)
支气管哮喘(bronchial asthma,BA)是儿童最常见的慢性呼吸道疾病之一。根据流行病学统计数据,我国城市儿童支气管哮喘发病率逐年上升[1]。支气管哮喘尚无有效的根治手段,主要是基于症状控制的管理模式,即遵循早开始、长期、规范、个体化原则,以控制急性发作、降低危险度分级及改善预后为主要治疗目标。
随着全球哮喘防治创议(Global Initiative for Asthma,GINA)在国内的推广及国家对公共卫生防治工作的投入,我国哮喘患者的总体控制水平较前已有明显提高[2],但仍低于发达国家。儿童支气管哮喘由于诊断困难、治疗依从性低及身处特殊生长发育时期等原因,目前我国儿童哮喘患者的总体控制水平尚不理想[3]。相关研究发现哮喘患者的呼吸道症状,如咳嗽、喘息、胸闷和呼吸困难等与精神心理状态密切相关,精神心理压力等因素可显著增加哮喘患者罹患抑郁症的风险,而抑郁等精神心理障碍又常导致反复的哮喘发作、ACT评分降低等,形成恶性循环,严重影响哮喘总体控制水平[4]。
儿童作为特殊群体,因其抑郁筛查、诊断及治疗的局限性,同时相关的临床实验存在伦理风险,故国内外关于儿童支气管哮喘合并抑郁障碍的相关研究报道较少。为研究两种疾病之间的发生、发展及转归关系等,本课题组选用幼龄SD大鼠制备支气管哮喘伴抑郁样行为动物模型,旨在为两者之间的探索和研究提供了一个客观、可靠、有效的手段。
1.1 材料
1.1.1实验动物:3周龄清洁级雄性SD大鼠32只,体质量(60±10)g,购于西安交通大学实验动物中心,实验动物生产许可证号【SCXK(陕)2023-002】,饲养于西安交通大学基础机能实验室动物房,实验动物使用许可证号【SYXK(陕)2023-004】,所有大鼠均适应性饲养5 d后随机分为群养对照组、孤养对照组、群养哮喘组、孤养哮喘组,每组8只,实验室环境:室温(23±2)℃,湿度恒定,持续通风,环境安静,采用12 h/12 h昼夜间断照明(7∶00—19∶00),标准饲料,消毒条件等同。每日早晚各观察大鼠1次(各项体征),每周称重大鼠1次并记录,群养对照组8只鼠群饲养于1笼(930 mm×620 mm×250 mm),孤养组均为单饲养(320 mm×180 mm×150 mm),各笼间隔10 cm,大小鼠笼间隔摆放,鼠笼以1次/周频次进行换笼,木屑垫料以2 天/次频次更换。
1.1.2实验药品及仪器:卵清蛋白(ovalbumin,OVA)及氢氧化铝(Sigma公司),IL-4、BDNF Elisa试剂盒(上海酶联生物),余试剂(均西安交通大学实验试剂中心),超声雾化泵(江苏鱼跃)。
1.2 方法
1.2.1模型制备:大鼠从3周龄开始进行为期4 d的适应性饲养,将初次糖水偏好实验结束记实验开始,在实验开始后第1,7,14天分别向群养对照组、孤养对照组的每只大鼠腹腔内注射1 mL 1×PBS缓冲液,群养哮喘组、孤养哮喘组的每只大鼠腹腔内注射1 mL OVA致敏液(每1 mL溶液含OVA 0.1 mg,氢氧化铝 50 mg),第15至21天分别对群养对照组、孤养对照组予80 mL 0.9%氯化钠溶液雾化熏蒸30 min,群养哮喘组、孤养哮喘组的大鼠给予80 mL OVA激发液(每1 mL溶液内含1 mg卵清蛋白)雾化熏蒸30 min,实验第22、23、24天行末次糖水偏好实验,实验第25、26天行强迫游泳实验,实验第27天早上8∶00分别给予80 mL 0.9%氯化钠溶液及80 mL OVA激发液雾化熏蒸30 min后安乐死,实验全程共27 d,实验安乐死时所有大鼠的鼠龄均为55日龄。
1.2.2糖水偏好实验:各组动物均于模型制备前后进行该实验,在第1天内,对所有大鼠均1鼠1笼饲养行适应性训练,每笼均置入两瓶浓度为1%的蔗糖水溶液,第2天分为两部分,前12 h将其中的一瓶蔗糖水溶液换成纯水,之后的12 h将蔗糖水溶液瓶及纯水瓶的位置进行交换,适应结束后,禁食禁水24 h,之后12 h同时给予大鼠事前称量好的糖水及纯水(为避免水瓶位置干扰,各组标记为单号大鼠的鼠笼中左侧为糖水,右侧为纯水,各组标记为双号大鼠的鼠笼中左侧为纯水,右侧为糖水),测试过程全程禁食,实验结束后分别对各笼中蔗糖水溶液瓶及纯水瓶进行称重,记录各液体消耗,并计算糖水偏好指数。SPI=糖水消耗量(g)/【糖水消耗量(g)+纯水消耗量(g)】×100%。
1.2.3强迫游泳实验:各组动物于末次糖水消耗实验后的第2天进行实验,第1个24 h对大鼠行适应性训练,置于40 cm(水深:20 cm,水温:24±1 ℃)透明塑料水桶中,行适应性游泳训练15 min,结束后室温烘干、归笼,第2天在同等条件下进行强迫游泳6 min,双盲记录每只大鼠在后5 min内出现“行为绝望”表现的时间(以双后肢是否出现活动为标准),取均值。
1.2.4血细胞分类及计数:末次雾化激发后,腹主动脉取血5 mL注入预先标记的 EDTA管中,常温下送至西安交通大学第一附属医院检验科行血常规五分类分析。
1.2.5血清中IL-4及BDNF测定:末次雾化激发后,腹主动脉取血5 mL注入预先标记的促凝管中,低温高速离心机2500 r/min离心20 min后取上层血清,ELISA法测定血清中IL-4及BDNF水平。
1.2.6肺组织HE染色:大鼠处死后,取右肺组织于4%多聚甲醛进行固定,常规石蜡包埋切片,HE染色后于光镜下观察肺组织变化。
1.3 统计学分析
2.1 体征变化情况
在致敏阶段各组大鼠精神状态佳,体型肥硕,呼吸正常,毛色鲜亮,仅孤养对照组及孤养哮喘组表现轻度活动量减少;在激发阶段,两对照组仅在激发初始阶段表现轻度烦躁不安,不停走动,余未出现异常行为。群养哮喘组则表现明显烦躁不安,出现互相撕咬、抓耳挠鼻、呼吸急促、点头呼吸等表现,归笼后出现胆小易惊等表现。孤养哮喘组则出现活动减少,呼吸节律不齐,口周轻度发绀,归笼后出现精神萎靡、活动减少、进食水减少等表现。激发结束后群养哮喘组及孤养哮喘组均出现毛色暗淡、活动减少等表现。
2.2 体质量变化情况
适应性饲养后各组大鼠体质量比较,差异无统计学意义(P>0.05);在哮喘大鼠模型的致敏过程(0～2周)中,各组体质量折线基本拟合,在激发过程(3周)中,两对照组体质量曲线未见明显差异(P>0.05),而群养哮喘组和孤养哮喘组体质量曲线均显著低于两对照组(P<0.05),孤养哮喘组体质量曲线显著低于群养哮喘组(P<0.05),见图1。
注:与两对照组比较,aP<0.05;与群养哮喘组比较,bP<0.05。Note:Comparison with the two control groups, aP <0.05;Comparison with the group asthma group, bP <0.05.
2.3 血细胞分类及计数
群养哮喘组及孤养哮喘组静脉血中白细胞计数高于两对照组(P<0.05),分类中主要以淋巴细胞为主,淋巴细胞计数明显高于两对照组(P<0.05),其中孤养哮喘组嗜酸粒细胞计数高于两对照组,群养哮喘组嗜酸粒细胞计数高于孤养哮喘组及两对照组,但差异无统计学意义(P>0.05),见表1。
表1 各组大鼠血细胞分类及计数Table 1 Classification and counting of
2.4 血清中IL-4及BDNF水平
群养哮喘组及孤养哮喘组血清中IL-4水平明显高于两对照组(P<0.05),孤养哮喘组血清中IL-4水平较群养哮喘组稍增高(P<0.05);两对照组血清中BDNF水平未见明显差异,群养哮喘组血清中BDNF水平低于两对照组,但差异无统计学意义(P>0.05),孤养哮喘组血清中BDNF水平明显低于两对照组(P<0.05),孤养哮喘组血清中BDNF水平低于群养哮喘组(P<0.05),见表2。
表2 各组大鼠血清中IL-4及BDNF水平Table 2 Levels of IL-4 and BDNF in
2.5 肺组织病理
群养对照组及孤养对照组大鼠支气管管壁形态规则,管腔光滑无闭塞,肺泡壁清晰完整,间隔形态正常,周围未见炎性细胞浸润;群养哮喘组及孤养哮喘组大鼠肺组织出现明显炎症,支气管管壁及周围组织可见大量炎性细胞浸润,肺泡壁炎性细胞浸润、肺泡内见渗出物,部分肺泡呈扩张状态(图2)。
图2 大鼠肺组织HE染色(×200)Fig.2 HE staining of rats lung tissue(×200)
2.6 糖水偏好实验
各组大鼠在初次糖水偏好实验中测得糖水偏好指数【糖水偏好指数(%)=糖水消耗量(g)/(糖水消耗量(g)+纯水消耗量(g)×100%】未见差异;末次糖水消耗实验中,孤养哮喘组较群养哮喘组及两对照组糖水偏好指数明显降低(P<0.05),在各组大鼠初末两次糖水消耗实验所测得糖水偏好指数对比中,两对照组及群养哮喘组的末次糖水偏好指数均较初次糖水偏好指数明显提高(P<0.05),孤养哮喘组的末次糖水偏好指数较初次糖水偏好指数降低(P<0.05)(表3)。
表3 各组大鼠糖水偏好指数Table 3 Sugar water preference index of
2.7 强迫游泳实验
在6 min强迫游泳实验中,群养哮喘组(32.64±9.09)较两对照组(31.77±8.36)(30.63±9.24)静止不动时间稍长,但差异无统计学意义(P>0.05)。孤养哮喘组(64.42±16.04)较群养哮喘组及两对照组静止不动时间长(P<0.05)。
支气管哮喘动物模型的制备常选用啮齿类动物,制备方法多为生物制品进行致敏激发,有研究应用OVA加氢氧化铝腹腔注射联合OVA溶液激发制备支气管哮喘大鼠模型[5];有研究采用RSV成功诱导出感染性哮喘小鼠模型[6];有研究采用屋尘螨滴剂成功制备支气管哮喘小鼠模型[7]。抑郁动物模型的建立因研究方向的不同其抑郁模型制备的方法也各有不同,有研究采用轻度不可逃避电刺激诱导大鼠获得性无助模型[8];采用不可预知的温和刺激来刺激大鼠产生抑郁[9];选用基因编辑技术构建Tph1/Tph2转基因鼠,通过降低大鼠体内色氨酸羟化酶的数量及活性来降低大鼠脑内5-HT水平,使其产生抑郁表现[10]。
传统复合动物模型的制备方法多为诱导动物单一疾病发病,在其基础上诱导产生另一种疾病,如有研究选用OVA对大鼠致敏激发后再通过轻度不可预见性应激来构建哮喘伴抑郁大鼠模型[11],尽管通过该方法制备的动物模型具有显著的抑郁特征,但应用于儿童哮喘伴抑郁的研究中仍存在诸多局限。与成年哮喘患者相比,儿童哮喘患者少有复合应激刺激的持续存在,更多的是由于哮喘发生、发展的过程出现的情绪低落,亦或是反复发作所导致的自卑、孤独及自信缺乏等轻度抑郁症状。相关研究调查发现,孤独感作为抑郁的先行因素,可稳定预测抑郁的发生[12],儿童时期随着同伴交往的重要性日益凸显,孤独感也随年龄显著提升,尽管一定的孤独体验有利于儿童健全人格的发展[13],但是长期的孤独体验势必会引起严重的自我否定,导致抑郁等情绪障碍。
为了尽可能确保动物模型符合儿童生长的特殊时期以及哮喘伴抑郁在发生、发展的时空一致性上,本研究中实验动物选用了3周龄雄性SD大鼠,在实验过程中同时诱发哮喘和抑郁发病,且在实验结束时所有大鼠均未达性成熟及社会性成熟的鼠龄低限[14-15],确保了模型能更好的反映儿童哮喘伴抑郁群体的病理、生理及免疫等特点。在哮喘模型制备方面,本研究主要参考Marta等所用的方法同时加以改进制备幼龄大鼠哮喘模型[16]。同时通过将属群居动物的SD大鼠通过单笼饲养来诱发其抑郁样行为,旨在模拟哮喘儿童在发病过程中常因请假就医导致缺席集体活动,或因惧怕哮喘急性发作而产生社交回避等行为。
实验结果显示,在激发阶段与两对照组相比,所有经过OVA生理盐水雾化激发的大鼠均出现了典型的哮喘症状,同时肺组织也出现了哮喘样气道损伤,全血细胞中白细胞总数、淋巴细胞计数及嗜酸粒细胞计数均增高,血清中IL-4含量升高等均符合典型支气管哮喘表现。抑郁模型的评价则选用大鼠症状、体质量、BDNF及行为学实验进行评估。糖水偏好实验是以实验动物对蔗糖水甜味的偏好来评价是否出现“快感缺失”,强迫游泳实验则是评价动物“行为绝望”的经典方法。在本次实验过程中,各组大鼠的初末次糖水摄取指数对比均明显升高,表明随着鼠龄的增长,大鼠对甜味的喜好逐渐增加,这一现象也基本符合在婴幼儿成长过程中随年龄增加对愉悦事物的兴趣度增加。
末次糖水偏好实验中仅孤笼哮喘组的大鼠出现糖水偏好指数降低,且强迫游泳实验中静止不动时间延长等均表明仅单笼饲养和仅OVA致敏激发不会导致大鼠出现抑郁样行为。在两对照组中,只改变鼠笼饲养条件,单笼饲养的大鼠仅出现轻度活动减少,而糖水偏好指数及强迫游泳实验中静止不动时间结果均无差异,说明鼠笼的选择作为单因素变量时并不会使大鼠出现抑郁样行为。从以上现象中不难推测对于儿童哮喘患者来说,或许孤独感的长期持续存在会导致患儿出现抑郁表现,但在躯体健康的情况下,短期的孤独感并不会影响其心理健康。而在两种负面因素的同时干预下,孤养哮喘组出现典型哮喘及抑郁样行为,也说明通过OVA来制备哮喘模型的过程中,同时施加孤独这一负面因素可使该动物模型达到预期要求。
本研究在鼠龄选择、制备方法等方面对以往哮喘伴抑郁共病模型的制备方法进行了改良,使其尽可能的模拟和还原儿童哮喘患者在哮喘的发生和发展过程中所出现的情形,同时制备方法可靠,且各项实验结果便于观察和分析,故能更好的适用于儿童支气管哮喘伴抑郁的相关问题研究,期望该模型能为以后进一步开展儿童哮喘伴抑郁的研究提供借鉴与帮助。
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