韩子阳，赵洋，唐欣如，张榕兰，冯静萱，王嘉羽，特木尔巴根，郭宇，武娅楠，张志丹，周伟光*
（1.内蒙古农业大学 兽医学院农业农村部动物疾病临床诊疗技术重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010018；
2.中美冠科生物技术有限公司，北京 100000；
3.内蒙古自治区动物疫病预防控制中心，内蒙古 呼和浩特 010020）
轮状病毒（rotavirus，RV）是造成人和动物腹泻最主要的病原体。牛轮状病毒（bovine rotavirus，BRV）是全球范围内造成犊牛腹泻的最主要病原体之一[1]。在大量的犊牛腹泻病例中，BRV 引起的犊牛腹泻发生率最高，约占犊牛腹泻病例的46%，有时高达100%，而死亡率相对较低，通常为10%左右，病畜多死于继发感染[2]。在我国河北、山西、云南、内蒙古、西藏和贵州等地牛群中，BRV 的感染也普遍存在[3]。因此，建立BRV 的快速检测方法成为犊牛腹泻防控的关键环节[4]。
BRV 属于呼肠孤病毒科轮状病毒属，为无囊膜双链RNA 病毒[5]，可通过粪口途径传播，多在早春、晚秋、冬季、气候骤变和卫生条件差的情况下发生[6]。该病毒可导致犊牛出现精神萎靡、腹泻和呕吐等临床症状[7]。犊牛出生2 周内，BRV 的分离率高达94%[8]，而随着感染牛月龄的增加，其常表现为隐性感染，无明显临床症状，诊断困难，导致养殖过程中易忽视BRV在牛群中的潜在传播，加快疾病蔓延速度。因此，建立有效快速的检测方法，对预防和控制BRV 感染具有重要意义[9]。RT-PCR 是目前检测该病毒最常用的方法，但在应用过程中存在一些不足，如操作复杂费时、局限在实验室操作等，不能完全满足基层快速、准确检测的需求[10]。
环介导等温扩增技术 （loop-mediated isothermal amplification，LAMP） 是一种新型的核酸扩增技术[11]，是近年发展起来的一项疾病快速临床诊断方法。LAMP 反应针对靶基因6～8 个区域设计4～6 条引物，仅需一种具链置换活性的DNA 聚合酶 （如Bst、Gsp等）便可在60～66 ℃的恒定温度下实现几十分钟内大于109～1010倍的靶基因扩增[12]。扩增产物可以通过浊度计、电泳和向试管反应中添加荧光染料进行检测[13]。这种变化可以用肉眼观察，非常适合现场检测[14]，同时LAMP 方法还有操作条件简单、操作方便的优点。建立快速检测BRV 的RT-LAMP 方法，有助于牛场犊牛腹泻的诊断和防控。
1.1 病毒、细菌及样品
牛传染性鼻气管炎病毒 （infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）、牛副流感病毒3 型（bovine parainfluenza virus，BPIV3）、大肠杆菌、沙门菌、BRV 和牛冠状病毒 （bovine coronavirus virus，BCV）由内蒙古农业大学兽医学院兽医传染病学教研室提供；
牛腹泻粪样均采自呼和浩特市周边的规模化养牛场，于实验室-80 ℃保存。
1.2 主要试剂
病毒DNA/RNA 基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA 凝胶回收试剂盒和克隆菌DH5α、dNTPs（10 mmol/L） 购自天根生化科技公司；
HiScript®II One Step RT-PCR Kit （Dye Plus） 试剂盒购于Vazyme 公司；
500 bp 和1 000 bp DNA marker、pMD19-T 购于TaKaRa 公司；
Bst 3.0 DNA 聚合酶（8 000 U/mL）、MgSO4（100 mmol/L）、10×ThermoPol反应缓冲液为New England Biolabs 公司产品；
SYBR Green I 购自百奥莱博。
1.3 主要仪器
高速冷冻离心机和梯度PCR 仪，德国Eppendorf公司；
台式离心机和生物安全柜，美国Thermo Scientific 公司；
凝胶成像仪，英国SYNGENE 公司。
1.4 试验方法
1.4.1 引物设计。参考GenBank 中的BRV NSP 序列，利用软件Lasergene 中的MegAlign 程序对BRV 的多个序列进行比对，根据对比结果利用Primer DesignV5 软件设计合成BRV 的RT-LAMP 反应所需的引物，结果如表1 所示（外引物为F3 和B3，内引物为FIP 和BIP）。
表1 RT-LAMP 扩增BRV 的引物序列
1.4.2 病毒和细菌核酸的提取。核酸提取参照DNA/RNA 基因组提取试剂盒的说明书进行。
1.4.3 BRV RT-LAMP 标准品的制备。用表1 中BRV RT-LAMP 外引物，通过对目的基因进行普通RT-PCR 扩增，反应体系模板为1.4.2 步骤提取的BRV RNA。反应体系：2×One Step Mix 12.5 μL、One Step Enzyme Mix 1.25 μL、F3 1.0 μL、B3 1.0 μL、模板2.0 μL、RNase-free ddH2O 7.25 μL；
反应程序：反转录50 ℃30 min；
预变性94 ℃3 min；
变性94 ℃30 s；
退火58 ℃30 s；
延伸72 ℃30 s；
终延伸72 ℃7 min，共35 个循环。参考AxyPreP DNA 凝胶回收试剂盒说明书，获得RT-PCR 纯化产物，将其与pMDTM19-T Vector 进行连接，取10 μL 的连接产物加入100 μL 的DH5α 感受态细胞中进行转化，提取BRV 重组质粒并进行PCR 和测序鉴定计算重组质粒pMD19T-BRV 质粒拷贝数。计算公式：质粒拷贝数（copies／μL）=6.02×（重组质粒浓度ng／μL×10-9）×1023/（660×重组质粒碱基数）。稀释阳性标准品时使用稀释液分别对重组质粒pMD19T-BRV 进行109～100（copies／μL）10 倍梯度稀释制成标准品，于-20 ℃保存。
1.4.4 RT-LAMP 方法的优化。RT-LAMP 方法的反应体系见表2。本试验针对反应体系Mg2+（100 mmol/L）、dNTPs（10 mmol/L）、内引物的用量以及反应条件时间和温度进行优化。其中，不同dNTP 的量分别为0.5、0.8、1.2、1.5 和1.8 μL；
不同Mg2+用量分别为0.2、0.5、0.8、1.2 和1.5 μL；
不同内引物用量分别为0.5、1、1.5、2 和2.5 μL（内引物浓度为10 μmol/L、外引物用量均为10 μmol/L，0.5 μL）；
通过试验的结果选择最佳RT-LAMP 反应体系。反应温度分别采用58.0、60.0、62.0、63.0、64.0、65.0 和66.0 ℃。反应时间分别采用30、45、60、90 和120 min；
对RT-LAMP 扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳分析。每次检测时，设置阴性对照（健康牛的基因组DNA）；
在阴性对照和阳性对照均成立时，整个试验有效，可判定结果。
表2 RT-LAMP 反应体系中各成分及其体积
1.4.5 RT-LAMP 检测BRV 的敏感性。将BRV 重组质粒进行10 倍梯度稀释，用于RT-LAMP 方法对BRV 的敏感性进行检测，并与普通的RT-PCR 对BRV 的敏感性进行比较。
1.4.6 RT-LAMP 检测BRV 的特异性。应用试剂盒提取IBRV、BPIV3、大肠杆菌、沙门菌和BRV 的核酸，以106copies/μL 的pMD19T-BRV 标准品作为阳性对照，通过SYBR Green I 对RT-LAMP 反应体系进行显色反应和凝胶电泳，对BRV 检测方法的特异性进行试验。
1.4.7 RT-LAMP 检测BRV 的重复性。选取终浓度为1×105copies/μL BRV 的重组质粒，运用建立并优化后的BRV RT-LAMP 检测方法，对模板进行3 组重复试验，验证该方法是否稳定。
1.4.8 RT-LAMP 用BRV 的临床检测。利用DNA/RNA 基因组提取试剂盒从腹泻粪样中提取RNA，再运用本试验建立的优化后的RT-LAMP 检测方法和普通RT-PCR 检测方法分别对38 份犊牛腹泻粪样进行检测，并比较这2 种方法的BRV 检出率，验证优化后的RT-LAMP 检测方法是否高效且信任度高。
2.1 BRV RT-LAMP 反应体系优化结果
如图1 所示，通过对dNTP（图1A）的用量、Mg2+（图1B）、内引物用量（图1C）、反应时间（图1E）和反应温度（图1D）5 个方面反应体系进行了优化，结果显示，dNTP （10 mmol/L） 最佳用量为2 μL，Mg2+（100 mmol/L）最佳用量为0.8 μL，内引物最佳用量为2 μL，最佳反应温度为62 ℃，最佳反应时间为45 min。
图1 BRV RT-LAMP 反应体系优化结果
2.2 RT-LAMP 检测BRV 敏感性
利用本试验建立的优化后的RT-LAMP 反应体系，对BRV 进行扩增反应，将按倍数稀释的BRV 重组质粒作为模板，同时将普通的RT-PCR 方法用于敏感度的比较。将2 种方法的扩增产物进行凝胶电泳检测，结果如图2 和图3 所示。普通RT-PCR 方法的敏感度为1×103copies/μL，而本试验建立的RT-LAMP方法的敏感度为1×102copies/μL。
图2 RT-PCR 检测BRV 敏感度结果
图3 RT-LAMP 检测BRV 敏感度结果
2.3 RT-LAMP 检测BRV 特异性
利用本试验建立的优化后的RT-LAMP 反应体系，对BRV 检测方法的特异性进行验证，结果如图4所示，只有BRV 的重组质粒有特异性扩增，反观其他细菌、病毒核酸和阴性对照均无特异性扩增，说明本试验建立的这种RT-LAMP 反应体系具有较好的特异性。
图4 RT-LAMP 检测BRV 特异性结果
2.4 RT-LAMP 显色法检测BRV 特异性
利用本试验建立的优化后的RT-LAMP 反应体系，对BRV 检测方法的特异性进行试验，并运用1 000×SYBR GREENⅠ对反应体系进行显色反应。结果如图5 所示，只有BRV 重组质粒显示特异的黄绿色，而其他细菌、病毒核酸和阴性对照为橙色，进一步证实了本试验建立的RT-LAMP 方法具有较好的特异性。
图5 RT-LAMP 显色法检测BRV 特异性结果
2.5 RT-LAMP 检测BRV 重复性
选取终浓度为1×105copies/μL 的BRV 的重组质粒，每种模板重复3 次，进行RT-LAMP 检测反应。如图6 所示，3 组模板对比无较大差异，说明本方法重复性较高，检测结果稳定性较好。
图6 RT-LAMP 检测3 组BRV 重复性结果
2.6 RT-LAMP 检测BRV 临床检测
通过2%的琼脂糖凝胶电泳分析，将本试验建立的BRV RT-LAMP 检测方法和普通RT-PCR 检测方法分别对38 份临床样品进行检测，如图7 和图8 所示，BRV 阳性率分别为47.4%和15.7%。结果证明RT-LAMP 检测方法BRV 的阳性样品检出率高于普通RT-PCR 检测方法。
图7 部分腹泻样品RT-PCR 检测BRV 的结果
图8 部分腹泻样品RT-LAMP 检测BRV 的结果
随着养牛业规模的不断扩大，犊牛轮状病毒感染率不断上升[6]，导致犊牛出现大量急性传染性肠道疾病，表现为腹泻、脱水等症状，甚至死亡，给牛场和养殖户带来巨大的经济损失。犊牛腹泻病因复杂，传染性病原包括病毒、细菌和寄生虫等，其中轮状病毒是引起犊牛腹泻的最主要病原之一。普通RT-PCR 检测轮状病毒，由于时间长、操作复杂，需要专业人员、专业设备来进行操作和运行，并不利于基层牧场或兽医人员进行现场快速检测。LAMP 作为一种新型的核酸扩增技术，已逐渐发展成为一种成熟可靠的分子生物学诊断方法，它突出的优势使其在一些国家和地区的病原检测中发挥着重要作用[15]。由于LAMP 在等温条件下扩增，较普通PCR 的三温度循环更简便，且扩增速度要快于普通PCR，故LAMP 用时短、易操作、无需高昂的精密仪器，更有利于现场的快速检测。近几年，研究者基于LAMP 技术开发出了纳米金-LAMP、LAMP-ELISA、电化学生物传感器-LAMP 和数字核酸-LAMP 等方法，提高了LAMP 的特异性和高效性[16]。
本试验通过对RT-LAMP 反应体系的Mg2+（100 mmol/L）、dNTPs（10 mmol/L）、内引物的用量以及反应条件时间和温度进行优化，建立了一种能够快速检测BRV 的RT-LAMP 方法。由于LAMP 扩增中使用的外引物用量较高，可导致一些引物二聚体或不匹配的情况出现，在LAMP 扩增期间出现假阳性的结果，故本试验严格按照LAMP 引物设计的原则，特别注意引物的Tm值、引物末端的稳定性、GC 含量和引物之间的距离[17]来设计引物。RT-LAMP 方法还容易引起交叉污染，本试验通过对实验室严格分区，试剂进行分装，严禁随意丢弃试验垃圾以避免交叉污染。范晴等[11]建立的检测BRV 的二重荧光RT-LAMP 方法，与本试验建立的方法敏感性一致，均有反应条件简单、特异、敏感、快速和稳定等优点。李巍等[18]建立的检测BRV 的RT-LAMP 方法，在等温条件下只需要50 min 就能检测出结果，并能特异地检测BRV，但是未见该方法应用于临床样品的检测。本试验的RTLAMP 检测方法经优化后，敏感性与普通PCR 相比提高了10 倍。在38 份临床样品检测中，RT-LAMP 和普通RT-PCR 方法监测BRV 的阳性率分别为47.4%和15.7%，结果表明，该BRV RT-LAMP 检测方法具有更高的检出率，可以满足快速检测的需要，并且本研究所采用的SYBR GreenⅠ染色方法操作简便、易于观察，为牛轮状病毒的现场快速检测提供技术支持。
综上所述，本试验建立的检测牛轮状病毒的RTLAMP 方法，具有快速、简便、灵敏度高和特异性强等特点，为基层牧场和专业实验室进行牛轮状病毒检测提供了技术支撑。
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